MXPA06003998A - Uso de efectores de ciclasas de glutamato y glutaminil. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona nuevos sustratos fisiologicos de ciclasa de glutaminil de mamifero (QC, EC, 2.3.2.5), nuevos efectores de QC y el uso de tales efectores y composiciones farmaceuticas que comprenden tales efectores para el tratamiento de enfermedades que pueden tratarse por modulacion de actividad de QC, por ejemplo, enfermedades seleccionadas del grupo que consiste de cancer duodenal con o c/o infecciones Heliobacter pylori, cancer colorectal, sindrome Zolliger-Ellison, Demencia de Familia Britanica y Demencia de Familia Danesa.

Description

USO DE EFECTORES DE CICLASAS DE GLUTAMATO Y GLUTAMI NI L CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a ciclasa de glutaminil (QC, EC 2.3.2.5) que cataliza la ciclización intramolecular de residuos de glutamina N-terminal en ácido piroglutámico (5-oxo-prolina, pGlu*) bajo liberación de amonio y la ciclización intramolecular de residuos de glutamato N-terminal en ácido piroglutámico bajo liberación de agua. La presente invención identifica las QCs de mamífero como metaloenzimas, proporciona nuevos sustratos fisiológicos de QC en mam íferos y el uso de efectores de QC y composiciones farmacéuticas que comprenden efectores de QC para el trataminto de condiciones que pueden tratarse por modulación de activación QC. Adicionalmente, se muestra que la interacción de metal es un procedimiento útil para el desarrollo de inhibidores de QC. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona el uso de efectores de actividad de QC en combinación con inhibidores de DP IV o enzimas tipo D IV para el tratamiento o alivio de condiciones que pueden tratarse por la modulación de actividad de DP IV y/o QC. También se proporciona un método de selección para la identificación y selección de efectores de actividad de QC.

ANTECEDENTES La ciclasa de glutaminil (QC, EC 2.3.2.5) cataliza la ciclización intramolecular de residuos de g lutam ina N-terminal en ácido piroglutám ico (pGlu*) liberando amonio. Una QC se aisló primero por Messer del látex de la planta tropical Carica papaya en 1 963 (Messer, M . 1963 Nature 4874, 1299). 24 años después, se descubrió una actividad enzimática correspondiente en la pituitaria de animal (Busby, W. H.J. eí al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. y Spiess, J. 1 987 Proc Nati Acad Sci U S A 84, 3628-3632) . Para la QC de mamífero, la conversión de Gin en pGlu por QC podría mostrarse para los precursores de TRH y Gn RH (Busby, W. H.J . eí al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W.H. y Spiess, J. 1 987 Proc Nati Acad Sci U S A 84, 3628-3632). Además, los experimentos de localización inicial de QC revelaron una co-localización con sus productos putativos de catálisis én pituitaria de bovino, mejorando además la función sugerida en la síntesis de hormona de péptido (Bockers , T.M. eí al. 1995 J Neuroendocrinol 7 , 445-453). En contraste, la función fisiológica de la planta QC es menos clara. En caso de la enzima de C. papaya, se sugirió una papel en la defensa de planta contra los microorganismos patogénicos (El Moussaoui, A. eí al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570). Las QCs putativas de otras plantas se identificaron por comparaciones de secuencia recientemente (Dahl , S.W. eí al. 2000 Protein Exp. Purif 20, 27-36). La función fisiológica de estas enzimas, sin embargo, todavía es ambigua.

Las QCs conocidas de plantas y animales muestran una especificidad estricta para L-Glutamina en la posición N-terminal de los sustratos y se encontró que su comportamiento cinético cumplió con la ecuación Michalis-Menten (Pohl, T. et al. 1 991 Proc Nati Acad Sci U S A 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. et al. , 1988 Anal Blochem 175, 1 31 -1 38; Gololobov, M. Y. et al. , 1 996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). Una comparación de las estructuras primarias de las QCs de C. papaya y aquella de la QC altamente conservada de mamíferos, sin embargo, no revelaron ninguna homología de secuencia (Dahl , S .W. et al. , 2000 Protein Exp. Purif 20, 27-36). Mientras que las QCs de planta parece que pertenecen a una nueva familia de enzima (Dahl, S .W. et al. 2000 Protein Exp. Purif 20, 27-36) , las QCs de mam ífero se encontró que ten ían una homolog ía de secuencia pronunciada hacia las aminopeptidasas bacterianas (Bateman , R. C. et al. 2001 Biochemistry 40, 1 1246-1 1250) , conduciendo a la conclusión de que las QCs de plantas y animales tienen diferentes origines evolutivos. EP 02 01 349.4 describe polinucleótidos que codifican la ciclasa de g lutaminil de insecto, así como también los polipéptidos codificados mediante la misma. Esta solicitud además proporciona células h uésped que comprenden vectores de expresión comprendiendo polinucleótidos de la invención . Los polipéptidos aislados y las células huésped que com prenden la QC de insecto son útiles en los métodos de selección para agentes que reducen la actividad de ciclasa de glutaminil. Tales agentes se describen como útiles como pesticidas. La enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por la acumulación anormal de placas amiloidóticas extracelulares asociadas aproximadamente con las neuronas distróficas, astrocitos reactivos y microglia (Terry, R. D. y Katzman, R. 1983 Ann Neurol 14, 497-506; Glenner, G. G. y Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Intagaki, S. et al. 1989 J Neuroimmunol 24, 173-182; Funato, H. et al. 1998 Am J Pathol 152, 983-992; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Los péptidos Amiloid-ß (?ß) son los componentes principales de placas seniles y se considera que se incluyen directamente en la patogénesis y avance de AD, una hipótesis se apoyó por estudios genéticos (Glenner, G. G. y Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Borchelt, D. R. et ai. 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere, C. A. et al. 1996 Nat Med 2, 1146-1150; ann, D. . e Iwatsubo, T. 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citrón, M. et al. 1997 Nat Med 3,67-72; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Ap se genera por procesamiento proteolítico de la proteína precursora ß-amiloide (APP) (Kang, J. et al. 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe, D. J. 1998 Trends Cell Biol 8, 447-453), la cual se dividió secuencialmente por secretasa en la terminal N y por ?-secretasa en la terminal C de Ap (Haass, C. y Selkoe, D. J. 1993 Cell 75,1039-1042; Simons, M. et al. 1996 J Neurosci 16 899-908). Además de los péptidos AD dominantes que comienzan con L-Asp en la terminal N (Ap1 -42/40), una gran heterogeneidad de formas truncadas en terminal N se origina en placas seniles. Tales péptidos acortados se reporta qué son más neurotóxicos in Vitro y se agregan más rápidamente que las ¡soformas de longitud completa (Pike, C. J. er al. 1995 J Biol Chem 270 23895-23898) . Los péptidos truncados en N se conocen por sobreproducirse en sujetos con AD familiar de inicio temprano AD (FAD) (Saido, T. C. et al. 1 995 Neuron 14, 457- 466; Russo, C. er al. 2000 Nature 405, 531-532), para aparecer tem prano y aumentar con la edad en cerebros con síndrome de Down (DS) (Russo, C. et al. 1 997 FEBS Lett 409, 411-416, Russo, C. et al. 2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian , T. L. et al. 1 998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94). Finalmente, su cantidad la severidad progresiva de la enfermedad (Russo, C. et al. 1 997 FEBS Lett 409, 411-416). Los procesos post-translacionales adicionales pueden además modificar la terminal N por isomerización o racemización del aspartato en posición 1 y 7 y por ciclización de glutamato en residuos 3 y 1 1 . Las isoformas que contienen piroglutamato en la posición 3 [pGlu3] AD((3-40/42))] representan las formas prominentes -aproximadamente 50% de la cantidad total de Ap- de las especies N-truncadas en placas seniles ( ori, H . et al. 1992 J Biol Chem 267, 17082- 17086, Saido, T. C. et al. 1 995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. et al. 1 997 FEBS Lett 409, 41 1-416; Tekirian, T. L. et al. 1 998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94; Geddes, J. W. et al. 1999 Neurobiol Aging 20, 75-79; Harigaya , Y. et al. 2000 Biochem Biophys Res Commun 276, 422-427) y también se presentan en lesiones con pre-amiloide (Lalowski, M. er al. 1 996 J Biol Chem 271, 33623-33631). La acumulación de péptidos ?ß?3(??) se debe probablemente a la modificación estructural que mejora la agregación y confiere resistencia a la mayoría de amino-peptidasas (Saido, T. C. eí al. 1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian , T. L. et al. 1 999 J Neurochem 73, 1584-1589). Esta evidencia proporciona pistas para un papel crucial de péptidos ?ß?3(??) en patogénesis AD. Sin embargo, se sabe relativamente poco acerca de su neurotoxicidad y propiedades de agregación (He, W. y Barrow, C . J . 1 999 Biochemistry 38, 10871- 10877; Tekirian, T. L. eí al. 1999 J Neurochem 73, 1584- 1589). Además, la acción de estas isoformas en células gliales y la respuesta glial para estos péptidos se desconocen completamente, a pesar de que el g lia activado se asocia estrictamente a las placas seniles y podría contribuir activamente a la acumulación de depósitos de amiloíde. En estudios recientes, la toxicidad , las propiedades de agregación y el catabolismo de péptidos ?ß 1 -42, ?ß 1 -40 [pGlu3]A 3-42 y [pGlu3]A 3-40 se investigaron en cultivos de célula glial y neuronal, y se mostró que la modificación de piroglutamato agrava las propiedades tóxicas de A-péptidos y también inhibe su degradación por astrocitos cultivados. Shirotani eí al. investigaron la generación de péptidos [pGlu3] en neuronas corticales primarias infectadas por el virus Sindbis in Vitro. Ellos construyeron los ADNs complementarios de proteína precursora amiloide, los cuales codifican un precursor potencial para [pGlu3]Ap por supresión y sustitución de aminoácido. Para un precursor artifical que comienza con un residuo de glutamina de N-terminal en lugar de glutamato en el precursor natural, una conversión espontánea o una conversión enzimatica por ciclasa de glutaminil en piroglutamato, se sugirió. El mecanismo de ciclización de glutamato de N-terminal en la posición 3 en el precursor natural de [pGlu3]Ap no se determinó in vivo (Shirotani, K. , Tsubuki, S . , Lee, H. J. , Maruyama, K. , y Saido, T. C. (2002) Neurosa' Lett 327, 25-28) . Demencia de Familia Británica (FBD) y Demencia de Familia Danesa (FDD) son desórdenes dom inantes autosomales de inicio temprano caracterizados por el deterioro cognoscitivo progresivo, espacidez y ataxia cerebral (Ghiso, J . et al. , 2000, Ann N Y Acad Sci 903, 129- 1 37; Vidal, R. et al. , 1999 , Nature 399, 776-781 ; Vidal , R. eí al. , 2004, J Neuropathol Exp Neurol 63, 787-800) . Similar a la enfermedad de Alzheimer, los depósitos amiloides vasculares y parenquimales esparcidos se forman en pcianetes acompañados por neurodegeneración del hipocampo, com plemente y activación glial (Rostagno, A. et al. , 2002, J Biol Chem 277, 49782-49790) . Las enfermedades se originan por diferentes m utaciones en el gen BRI (SwissProt Q9Y287) conduciendo a una estructura de lectura abierta que es de 1 1 aminoácidos más larga en comparación a BRI tipo silvestre. En caso de FBD, el cambio en la ORF se origina por una mutación en el codón de detención de BRI (BRI-L) , mientras que en FDD una duplicación-inserción de diez nucleótidos conduce a BRI más grande (BRI-D) (Ghiso, J. eí al. , 2001 Amyloid 8, 277-284; Rostagno, A. et al. , 2002 J Biol Chem 277, 49782-49790). BRI , una clase de proteína de transmembrana 2 codifica en el cromosoma 13, se ha mostrado que se procesa por furina y otras convertasas de prohormona en la región de C-terminal, liberando un péptido largo de 23 aminoácidos (Kim, S. H. et al. 2000 Ann N Y Acad Sci 920, 93-99; Kim, S.H. ef al. , 2002 J Biol Chem 277, 1872-1877). La división de las proteínas de BRI mutantes BRI-D y BRI-L conduce a la generación de péptidos (Abri y Adán, ambos 34 aminoácidos) (El Agnaf, O.M. et al. , 2004 Protein Pept Lett 11 , 207-212; El Agnaf, O.M ef al. , 2001 J Mol Biol. 310, 157-168; Srinivasan et al. 2003 J Mol Biol 333, 1003- 1023). Los péptidos ADan y Abri son idénticos en la N-terminal de 22 aminoácidos, pero contienen distinas regiones de C-terminal. Las partes de C-terminal se ha mostrado que requieren formación de fibrilos y neurotoxicidad (El Agnaf, O.M et al. 2004 Protein Pept Lett 11, 207-212). Se ha mostrado que la N-terminal de los péptidos ABri y ADan se bloquea por formación de piroglutamilo. De acuerdo a formación de piroglutamilo en la N-terminal de ?ß en enfermedad de Alzheimer, pGlu se forma de ácido glutámico (Ghiso J. ef al. 2001 Amyloid 8, Saido et al. , 1995 Neuron 14, 457-466). La formación de piroglutamilo, a su vez, estabiliza los péptidos hacia la degradación por la mayoría de las aminopeptidasas provocando de esta manera el avance de las enfermedades. La formación de agregados se ha mostrado que procede extracelularmente pero también en la trayectoria secretoria de las células (Kim ef al., 2002 J Biol Chem 277, 1872-1877) . Por lo tanto, la supresión de la formación de pGlu en la N-terminal de péptidos Abri y ADan neurotóxicos por inhibición de ciclasas de glutaminilo y glutamato representa un nuevo procedimiento para tratar FBD y FDD.

La peptidasa de dipeptidilo IV (DP IV) es una post-prolina (a un grado menor de post-alanina, post-serina o post-glicina) que divide la proteasa de serina encontrada en varios tejidos del cuerpo incluyendo riñon, hígado, e intestino y divide los dipéptidos de N- terminal de una cadena péptida. Recientemente se mostró que DP IV juega un papel importante en el metabolismo de neuropéptido, la activación de célula T, unión de células cancerosas al endotelio y la entrada de VIH en células linfoide. Véase por lo tanto WO 02/34242, WO 02/34243, WO 03/002595 y WO 03/002596. Los inhibidores de DP IV descritos en WO 99/61431 comprenden un residuo de aminoácido y un grupo pirrolidina o tiazolidina, y sales de los mismos, especialmente tiazolidina de L-treo-isoleucil, tiazolidina L-alo-isoleucil, pirrolidina de L-treo-isoleucil, tiazolidina de L-alo-isoleucil, pirrolidina de L-alo-isoleucil. Los ejemplos adicionales de inhibidores de peptidasa de dipeptidilo IV de bajo peso molecular son agentes tales como derivados de tetrahidroisoquinolin-3-carboamida, 2-cianopirolas N-sustituidas y pirrolidinas, N-(N'-glicil sustituido)-2-cianopirrolidinas, N-(glicil sustituido)-tiazolidinas, N-(glicil sustituido)-4-cianotiazolidinas, amino- y acil-boro-prolil-inhibidores, pirrolidinas ciclopropil-fusionadas y compuestos heterocíclicos. Los inhibidores de peptidasa de dipeptidilo IV se describen en E.U. 6,380,398, E. U. 6,01 1 , 155; E. U. 6, 107,317; E. U. 6, 1 10,949; E.U. 6, 124,305; US 6, 172, 081 ; WO 95/15309, WO 99/61431 , WO 99/67278, WO 99/67279, DE 198 34 591 , WO 97/40832, DE 196 16 486 C 2, WO 98/1 9998, WO 00/07617, WO 99/38501 , WO 99/46272, WO 99/38501 , WO 01 /68603 , WO 01 /40180, WO 01 /81 337, WO 01 /81 304, WO 01 /551 05, WO 02/02560 y WO 02/14271 , WO 02/0461 0, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541 , WO 03/0001 80, WO 03/0001 81 , WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531 , WO 03/002553, WO 03/002593 , WO 03/004496, WO 03/024942 y WO 03/024965, las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad, especialmente concerniente a estos inhibidores, su definición , usos y su producción .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevos sustratos fisiológicos de QC en mam íferos, ?ß((3-40/42)) , [T??3]?ß((3-40/42)), y [Gln1]Gastrinas (17 y 34), y el uso de efectores de QC y composiciones farmacéuticas que com prenden efectores de QC para el tratamiento de condiciones que pueden tratarse por modulación de actividad de QC, preferentemente seleccionado del grupo que consiste de cáncer duodenal con o c/o infecciones Heliobacter pylori, cáncer colorectal, síndrome Zolliger-Ellison, Demencia de Familia Británica y Demencia de Familia Danesa. Se mostró por estudios de inhibición que la QC h umana es una transferasa dependiente de metal. La apoenzima QC podría reactivarse más eficazmente por iones de zinc, y el motivo de unión por metal de aminopeptidasas dependientes de zinc también se presenta en QC humana. Los compuestos que interactúan con el metal unido por sitio activo son inhibidores potentes de QC. Inesperadamente, se mostró que la QC humana recombinante así como también la actividad QC de extractos cerebrales catalizan tanto, glutaminil de /V-terminal así como también la ciclización de glutamato . Más notable es el descubrimiento, que la Glu1-conversión catalizada por ciclasa se favorece alrededor de pH 6.0 mientras que la Gln -conversión en derivados pGlu se origina con un pH óptimo de aproximadamente 8.0. Ya que la formación de péptidos relacionados a pGlu-?ß puede suprimirse por inhibición de QC humana recombinante y actividad de QC de extractos de pituitaria de cerdo, la enzima QC es un objetivo en desarrollo de fármaco para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para la administración parenteral, enteral u otral, comprendiendo al menos un efector de QC opcionalmente en combinación con vehículos normales y/o excipientes; o comprendiendo al menos un efector de QC en combinacio'n con al menos un inhibidor DP IV, opcionalmente en combinación con vehículos y/o excipientes normales. La presente invención proporciona inhibidores QC que pueden describirse generalmente por la fórmula 1 o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, incluyendo todos los estereoisómeros: f m ñ 1 en donde R1 - R6 son independientemente H o una cadena de alquilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquenilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquinilo ramificado o no ramificado, carbocíclico, arilo, heteroarilo, heterocíclico, ácido aza-amino, aminoácido o un mimético de los mismos; todos los residuos antrioeres opcionalmente sustituyéndose y n puede ser 0-2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS El entendimiento adicional de estos y otros aspectos de la presente invención se tendrá por referencia a las figuras en donde: La Figura 1 muestra las curvas de progreso de la ciclización de H-Gln-Ala-OH, catalizada por QC humana, monitoreando la reducción en absorción a 340 nm. Las muestras contuvieron 0.3 mM de NADH/H+, 14 mM de ácido a-cetoglutárico, 30 U/ml de dehidrogenasa glutámica y 1 mM de H-Gln-Ala-OH, de la curva A-D, se aplicaron concentraciones variantes de QC: A, 10 mU/ml, B, 5 mU/ml, C, 2.5 mU/ml. En caso de la curva D, se omitió la QC. Una relación lineal se obtuvo entre la concentración de QC y la actividad observada (inserción). La Figura 2 m uestra la dependencia de pH de QC de papaya y humano (inserción) , determ inada bajo las condiciones de tasa de primer orden utilizando Gln- ?NA como sustrato. En caso de QC humana, un sistema de regulador que proporciona una resistencia iónica constante de acuerdo a Ellis y Morrison se utilizó, consistiendo de 25 mM de MES , 25 m M de ácido acético y 50 mM de Tris (Ellis, K. J y Morrison, J. F. 1 982 Methods Enzymol. 87, 405-426). Debido al efecto ligeramente inh ibidor de Tris, QC de papaya se investigó utilizando un reg ulador de 50 mM de Mops. La resistencia iónica se ajustó a 0.05 M por adición de NaCI. Las configuraciones de la tasa se evaluaron al ajustarse a un modelo q ue se basa en grupos de disociación. En caso de QC de papaya, un pKa de 7. 1 3 + 0.03 se obtuvo por ajuste de los datos a un modelo de disociación único. La Figura 3 m uestra el efecto del pH en la estabilidad de la QC de látex de Papaya y QC humana . Una solución concentrada de enzima se diluyó 20 veces en 0.1 M de regulador de varios valores pH (pH 4-7 citrato de sodio, pH 7-1 0 fosfato de sodio). Las soluciones de enzima se incubaron a 30°C por 30 min y por consecuencia la actividad enzimática se analizó de acuerdo al protocolo estándar. La Figura 4 muestra la comparación de la constante de especificidad Kcat/Kivi por un grupo de sustratos que contienen glutamato en la segunda posición de aminoácido. Mientras que un aumento en la especificidad de QC humana se detectó de los di- a los tetrapéptidos, no se observó cambio en el caso de QC de papaya. La información presentada aquí es un re-diagrama de los parámetros datos en la Tabla 3. La Figura 5 m uestra la formación de pGlu-Lys(pGlu)-Arg- Leu-Ala-NH2 de H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-N H2, catalizada por QC humana. La conversión de sustrato se monitorea por un cambio dependiente de tiempo en la proporción m/z debido a la expulsión de amonio. La composición de muestra fue 0.5 mM de sustrato, 38 n de QC en 40 mM de Tris/HCI, pH 7.7. En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. Se observó dependencia muy similar en caso de QC de papaya. La Figura 6 muestra la formación de pGlu-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 de H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 catalizada por QC de papaya. La conversión de sustrato se monitorea por un cambio dependiente de tiempo en la proporción m/z debido a la expulsión de metilamina. La composición de muestra fue 0.5 mM de sustrato, 0.65 µ? de QC de papaya en 40 mM de Tris/HCI, pH 7.7. En los tiem pos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron . No se observó la conversión de sustrato en las muestras con QC de papaya o al aplicar hasta 1 .5 µ? de QC humana al sustrato (no mostrado). La Figura 7 muestra la formación de [Gln3]-A ((3- 1 )a)a de [T??3]?ß((1 -1 1 )a)a catalizada por DPIV. En los tiempos indicados, las muestras se removieron, del tubo de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 8 muestra la prevención de la división de [Gln3]Ap((1 -1 1 )a)a por el inhibidor DPIV Val-Pirrolidida (Val-Pyrr). En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 9 muestra la formación de [pGlu3]-Ap((3-1 1 )a)a de [Gln3]Ap((1 -1 1 )a)a catalizada por QC. En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 10 muestra la inhibición de la formación de [pGlu3]A (3-1 1 )a de [Gln3]Ap(3- )a por el inhibidor QC 1 ,10-fenantrolina. En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 11 muestra la formación de [pGlu3]A (3-1 1 )a de [Gln3]A (1 - )a después de la catálisis consecutiva por DP IV y QC. En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1 : 1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron.

La Figura 12 muestra la inhibición de la formación de [pGlu3]Ap(3-11)a de [Gln3]Ap(1-11)a por el inhibidor de QC 1,10-fenantrolina en la presencia de DP IV catalíticamente activa y QC. En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1:1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 13 muestra la reducción de la formación de [pGIu3]Ap(3-11)a de [Gln3]Ap(1-1 )a por el inhibidor DP IV Val-Pyrr en la presencia de DP IV catalíticamente activa y QC. En los tiempos indicados, las muestras se removieron de la mezcla de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1:1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 14 muestra la formación de [pGlu3]A -péptido(3-11)a de [Gln3]A (1-11)a después de la catálisis consecutiva por aminopeptidasa(s) y QC que se presentan en homogenato de pituitaria de cerdo. En los tiempos indicados, las muestras se removieron del tubo de ensayo, se mezclaron con la solución de aglomerante (1:1 v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. La Figura 15 A y B muestran los espectros de masa de Ap(3-11)a y Ap(3-21)a incubados con QC humana recombinante, la cual se hirvió por 10 minutos antes de utilizarse. C y D muestran los espectros de Masa de A (3-11)a y Ap(3-21)a en presencia de QC humana activa dando como resultado la formación de [pGlu3]A (3-11)aa y [pGlu3]AP(3-21)a, respectivamente. E y F muestran los espectros de Masa de A (3-11)aa y Ap(3-21)a en presencia de QC activa y 5 mM de Bencimidazol que suprime la formación de [pGlu3]formación. La Figura 16 muestra las tasas de reacción de la Glu-ytfNA-conversión catalizada por QC de papaya trazada contra la concentración de sustrato. Las tasas iniciales se midieron en 0.1 M de regulador de fosfato, pH 6.1 (cuadros), 0.1 M de regulador de fosfato, pH 7.5 (círculos) y 0.1 M de regulador de borato, pH 8.5 (triángulos). Los parámetros cinéticos fueron como sigue: M= 1.13+0.07 mM, koat=1.13+0.04 min" (pH 6.1); KM=1.45+0.03 mM, kcat=0.92+0.01 min"1 (pH 7.5); KM=1.76+0.06 mM, kcat=0.56+0.01 min"1 (pH 8.5). La Figura 17 muestra la dependencia de pH de la conversión de Gln-^NA (círculos) y Glu-/?NA (cuadros), determinada bajo las condiciones de ley de proporción de primer orden (S<<KM). La concentración de sustrato fue 0.01 mM y 0.25 mM, respectivamente. Para ambas determinaciones, un sistema de regulador de tres componentes se aplicó consistiendo de 0.05 M de ácido acético, 0.05 M de ácido pirofosfórico y 0.05 M de Tricita. Todos los reguladores se ajustaron a conductividad igual por adición de NaCI, a fin de evitar las diferencias en resistencia iónica. Los datos se ajustaron a ecuaciones que cuentan para dos grupos de disociación revelando los valores pKa de 6.91 + 0.02 y 9.5 + 0.1 para Gln- ?NA y 4.6 + 0.1 y 7.55 + 0.02 para Glu-/?NA. Los valores pKa de los grupos amino de sustrato respectivos, determinados por concentración, fueron 6.97 + 0.01 (Gln-/?NA) y 7.57 + 0.05 (Glu-^NA). Todas las determinaciones se llevaron a cabo a 30°C. La Figura 18 muestra las curvas de progreso de ciclización catalizada por QC humana de H-GIn-AMC en presencia de imidazol, ácido dipicolínico y en ausencia de un compuesto inhibidor. La forma hiperbólica de la curva en presencia de ácido dipicolínico indica la remoción de ión metálico del sitio activo de QC. La Figura 19 muestra la inactivación dependiente de tiempo de QC por el quelador heterocíclico 1 , 10-fenantrolina. Después de la incubación de la enzima QC con el inhibidor en ausencia de sustrato (línea continua), una actividad enzimática reducida se observó en comparación a las muestras que no se preincubaron con inhibidor (trazo punteado), indicando la remoción de ión metálico del sitio activo de QC. La Figura 20 muestra la reactivación de QC humana con iones de metal divalente y monovalente. QC se indicó por adición de 2 mM de ácido dipicolínico en 50 mM de Bis-Tris, pH 6.8. Por consecuencia, la enzima se sometió a diálisis contra 50 mM de Bis-Tris, pH 6.8, conteniendo 1 .0 mM de EDTA. La reactivación de las enzimas se logró por incubación de la muestra de enzima inactivada con iones metálicos a una concentración de 0.5 mM, en presencia de 0.5 mm de EDTA a fin de evitar la reactivación no específica por indicios de iones metálicos presentes en soluciones reguladoras. Los controles se dan por muestras de enzima que no se inactivaron, pero también se dializaron contra la solución de EDTA como la enzima inactivada (+EDTA) y las m uestras de enzima que se dializaron contra las soluciones reg uladoras sin EDTA agregado (-EDTA) . Figu ra 21 Alineación de secuencia de QC humana (hQC) y otros miembros de la familia M28 de la metalopeptidasa Clan MH. La alineación de secuencia múltiple se realizó utilizando CíustalW en ch. EMBnet. org con fijaciones de defecto. La conservación de los residuos de ligación por ión de zinc se muestra para QC humana (hQC; GenBank X71 125) , la aminopeptidasa dependiente de Zn de Streptomyces griseus (SGAP; Swiss-Prot P80561 ) , y dentro del dominio de dipeptidasa ácida N-acetilada-alfa-ligada (NAALADase I) (residuos 274-587) de la carboxipeptidasa de Glutamato humano II (Hgcp ii; Swiss-Prot Q04609) . Los aminoácidos incluidos en la unión metálica se mecanografían en negro y se subrayan . En caso de QC humana, estos residuos son las contrapartes putativas a las peptidasas. Figura 22 muestra la pH-dependencia de inhibición de QC m urino por cisteamina (cuadros) , dimetil-cisteamina (círculos) y mercaptoetanol (triángulos). Los puntos se fijaron a ecuaciones que cuentan para un grupo de disociación . Las curvas revelan diferentes formas, indicando q ue la dependencia es debido a las alteraciones en el estado de protonización del inhibidor. Los valores pKa cinéticamente determinados para cisteamina (8.71 + 0,07) y dimetil-cisteamina (8.07 + 0.03) se igualan bien con aquellos obtenidos de los datos de literatura para el grupo amino (8.6 y 7.95, respectivamente) (Buist, G. J y Lucas, H. J. 1957 J Am Chem Soc 79, 61 57; Edsall , J .

T. Biophysical Chemistry, Academic Press, I nc. , New York, 1958). De acuerdo con lo anterior, la pH-dependencia de mercaptoetanol posee una pendiente de unidad, ya que no lleva un .grupo disociador en el rango de pH investigado. Figura 23 muestra una diagrama Lineweaver-Burk de los datos cinéticos obtenidos para la conversión de Gln-A C (0.25, 0. 125, 0.063, 0.031 mM), catalizados por QC humana en presencia de varias concentraciones de cisteam ina (0, 0.25, 0.5, 1 mM) . Los datos se fijaron de acuerdo a la inhibición competitiva. Ei valor de Kl determinado fue 0.037 + 0.001 mM.

Secuencias de Péptido Los péptidos mencionados y utilizados en la presente tienen las siguientes consecuencias: ?ß1-42: Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Calu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe- P e-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu- et-Val-Gly-Gly-Val- Val-lle-Ala ?ß1-40: Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-Hls-Gln-Lys-Leu-Val-P e- Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-GIy-Ala-lle-lle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val- Val ?ß3- 2: Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Giy-Tyr-Glu-Vai-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala- Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-lle-Gly-Leu- et-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala ?ß3-40: Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-GIy-Tyr-Glu-Val-His-His-Gfn-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala- Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lle-Gly-Leu- et-Val-Gly-Giy-Val-Val ?ß?-Ha: ' Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NHa Ap3-11a: G!u-Pfie-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 A|31-21a: Asp-Ala-Glu-P e-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-GIn-Lys-Leu-Val-Phe- Phe-Ala-NH2 Ap3-21a: G/u-Phe-Arg-His-Asp-Ser-G)y-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala- NH2 Gln3-Ap3- 0: Gln-Pha-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-P e-Ala- Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lie-Gly-Leu- et-Val-Gly-GIy-Val-Val Gln3-Ap3-21a: Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala- NH2 G!n3-Api-11a: Asp-Ala-Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 Gln3-Ap3-11a: Gln-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-NH2 ABri pGlu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-ala-l le-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-A!a Val-Glu-Thr-Leu-l le-Cys-Ser-Arg-Thr-Val-Lys-Lys-Asn-lle-l le-Glu-Glu Asn GLU1-ABri Glu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-lle-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-Ala- Val-Glu-thr-Leu-lle-Cys-Ser-Arg-Thr-Val-Lys-Lys-Asn-l le-lle-Glu-Glu- Asn ADan pGlu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-lle-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-AIa-Val-Glu-Thr-Leu-lle-Cys-Phe-Leu-Asn-Ser-Gln-Glu-Lys-His-Tyr.

GLU1-ADan Glu-Ala-Ser-Asn-Cys-Phe-Ala-lle-Arg-His-Phe-Glu-Asn-Lys-Phe-Ala- Val-Glu-Thr-Leu-lle-Cys-Phe-Asn-Leu-Phe-Leu-Asn-Ser-Gln-Glu-Lys- His-Tyr DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona efectores de ciclasa de glutaminil (QC) para a) el tratamiento de enfermedades en mamíferos que pueden tratarse por modulación de la actividad de QC in vivo lo b) la modulación de procesos fisiológicos basados en la acción de péptidos que contienen pGlu originados por la modificación de la actividad de QC. Además, la presente invención proporciona compuestos para la inhibición de ciclasa de glutaminil (QC, EC 2.3.2.5) y/o enzimas tipo QC en un mamífero y el uso de inhibidores de actividad de QC para el tratamiento de condiciones patológicas relacionadas a la actividad de QC. La presente invención también proporciona un nuevo método para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer y Síndrome de Down. Los ß-péptidos de amiloide de term inal N depositados en cerebro con enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down llevan el ácido piroglutámico . La formación de pGlu es un caso importante en el desarrollo y avance en la enfermedad, ya que los ß-péptidos de amiloide modificados m uestran una tendencia mejorada a la agregación de ß-amiloide y toxicidad, probablemente empeorando el inicio y avance de la enfermedad . (Russo , C. et al. 2002 J Neurochem 82, 1480- 1489) . En contraste, en los ?ß-péptidos naturales (((3-40/42))), el ácido glutám ico se presenta como un aminoácido de N-terminal. No existe conversión enzimática de Glu a pGlu conocida a la fecha. Además, la ciclización espontánea de Glu-péptidos a pGlu-péptidos no se ha observado todavía . Por lo tanto, un aspecto de la presente invención fue determinar el papel de QC en la enfermedad de Alzheimer y S índrome de Down . Este aspecto se denom inó por la síntesis de ?ß3-1 1 y ?ß1 -1 1 , conteniendo la glutamina aminoácida en lugar de ácido glutámico en la posición tres , la determinación de las características de sustrato de estos ß-péptidos de am iloide modificados contra QC, DP IV y enzimas tipo DP IV y am inopeptidasas y el uso de inhibidores de QC para prevenir la formación de pGlu de un residuo de glutaminil de N-terminal de los péptidos ß-derivados de amiloide 1 -1 1 y 3-1 1 . Los resultados se muestran en el ejemplo 8. El método aplicado se describe en el ejemplo 3.

A la fecha, no existen pistas que indiquen una participación de QC en el avance de la enfermedad, debido a que el ácido glutámico es el aminoácido de N-terminal en ?ß (((3-40/42)), o 1 (1 -40/42)). Pero, QC es la enzima únicamente conocida capaz de formar pGlu en la N-terminal de los péptidos. Otros aspectos de la presente invención se refieren a los siguientes descubrimientos y hallazgos: a) en una reacción secundaria, QC cataliza la ciclización de ácido glutámico en ácido piroglutámico a tasas muy bajas, b) Ácido glutámico de APP o su amiloide- -péptidos subsecuentemente formados se convierte en glutamina de manera post-translacional por una actividad enzimática desconocida y en una segunda etapa, QC cataliza la ciclización de glutamina en ácido piroglutámico después del procesamiento de la N-terminal de ß-péptido amiloide, c) El ácido glutámico se convierte en glutamina de manera post-translacional por una catálisis química o autocatálisis y subsecuentemente, QC cataliza la ciclización de glutamina en acido piroglutámico después del procesamiento de la N-terminal de ß- péptido amiloide. d) Existen mutaciones en el gen APP, que codifican la ß-proteína de amiloide, conduciendo a Gln en lugar de Glu en posición 3. Después de la traducción y procesamiento de la N-terminal, QC cataliza la ciclización de glutamina en ácido piroglutámico, e) La glutamina se incorpora en la cadena péptida naciente de APP, debido a la mal funcionamiento de la actividad enzimática desconocida y subsecuentemente, QC cataliza la ciclización de glutamina de manera N-terminal en ácido piroglutámico después del procesamiento de la N- terminal de' -péptido amiioide. QC se incluye en la etapa crítica en todos los cinco casos anteriormente listados, principalmente la formación de ácido piroglutámico que favorece la agregación de ß-péptidos de amiioide. De esta manera, una inhibición de QC conduce a una prevención de la precipitación de ?ß3-40/41 -43 o ?ß 1 (1 -40/42) formadoras de placas, originando el inicio y avance de la enfermedad de Alzheimer y Síndrome de Down, independientemente del mecanismo mediante el cual se origina la ciclización. El glutamato se encuentra en las posiciones 3, 1 y 22 del ß-péptido de amiioide. Entre ellas la mutación de ácido glutámico (E) en glutamina (Q) en la posición 22 (correspondiente a la proteína precursora amiioide APP 693, Prot-Suizo P05067) se ha descrito como la tan llamada mutación de amiloidosis cerebroarterial tipo holandesa.

Los péptidos ß-amiloide con un residuo de ácido piroglutámico en posición 3, 11 y/o 22 se han descrito por ser más citotóxicos e hidrofóbicos que ?ß(1-40/42)/43 (Saido T.C. 2000 Medical Hipotheses 54(3):427-429). Las múltiples variaciones de N-terminal pueden generarse por la enzima de división de proteína precursora de amiloide de ß-sitio de enzima ß-secretasa (BACE) en diferentes sitios (Huse J.T. eí al. 2002 J. Biol. Chem. 277 (18): 16278-16284), y/o por procesamiento de aminopeptidasa. En todos los casos, la ciclización puede tener lugar de acuerdo a a)-e) según se describe anteriormente. Hasta ahora, no hubo evidencia experimental que soporte la conversión enzimática de Glu'-péptidos en pGlu-péptidos por una ciclasa de glutamil desconocida (EC) correspondiente a la trayectoria a) (Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S., y Sweedler, J. V. (1999) J Neurochem 72, 676-681; Hosoda R. eí al. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57,1089-1095). A la fecha no se ha identificado tal actividad de enzima, capaz de ciclizar Glu'-péptidos los cuales se protonizan de manera N-terminal y poseen una porción de ?-carboxilato Glu negativamente cargada bajo condiciones de pH medianamente alcalino. La actividad QC contra los Gln -sustratos se reduce dramáticamente debajo de pH 7.0. En contraste, parece que la Glu -conversión puede originarse en las condiciones de reacción ácida ( (Iwatsubo, T., Saido, T. C, Mann, D. M., Lee, V. M., y Trojanowski, J. Q. (1996) Am J Pathol 149,1823-1830; Russo, C, Saido, T. C, DeBusk, L. M., Tabaton, M., Gambetti, P., y Teller, J. K. (1977) FEBS Lett 409,411-416; Russo, C, Salis, S., Dolcini, V., Venezia, V., Song, X. H., Teller, J. K., and Schettini, G. (2001) Neurobiol Dis 8,173- 180; Tekirian, T. L, Saido, T. C, Markesbery, W. R., Russell, M. J., Wekstein, D. R., Patel, E., y Geddes, J. W. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57,76-94; Russo, C, Violai, E., Salis, S., Venezia, V., Dolcini, V., Damonte, G., Benatti, U., DArrigo, C, Patrone, E., Cario, P., y Schettini, G. (2002) J Neurochem 82,1480-1489; Hosoda, R., Saido, T. C, Otvos, L, Jr., Arai, T., Mann, D. M., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., e Iwatsubo, T. (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57,1089-1095; Garden, R. W., Moroz, T. P., Gleeson, J. M., Floyd, P. D., Li, L. J., Rubakhin, S. S., y Sweedler, J. V. (1999) J Neurochem 72, 676-681). De acuerdo a la presente invención se investigó si QC es capaz de reconocer y convertir los péptidos derivados de amiloide-ß bajo condiciones medio ácidas. Por lo tanto, los péptidos [???3]?ß1-11a, ?ß(3-11)3, [Gln3]Ap(3-11)a, ?ß3-123, [??3]?ß3-2?3 y [???3]?ß3-40 como sustratos potenciales de la enzima se sintetizaron y se investigaron. Estas secuencias se seleccionaron para imitar los péptidos |???3]?ß y péptidos | ??3]?ß de manera terminal C y terminal N natural los cuales podrían presentarse debido a la Glu-amidación post-translacional. En la presente invención se mostró que QC humana y de papaya catalizan tanto la ciclización de glutaminil como glutamil. Aparentemente, la función fisiológica primaria de QC es acabar la maduración hormonal en células endocrinas por ciclización de glutamina antes o durante el proceso de secreción hormonal. Tales vesículas secretoras se conoce que son ácidas en pH. De esta manera, una actividad secundaria de la enzima en el rango de pH estrecho de 5.0 a 7.0 podría ser su actividad de ciclasa de glutamil recientemente descubierta transformando también los péptidos Glu-?ß. Sin embargo, debido a la más lenta que presenta Glu-ciclización en comparación a la Gln-conversión, es cuestionable si la ciclización de glutamil juega un papel fisiológico significante. En la patología de desórdenes neurodegenerativos, sin embargo, la ciclización de glutamil es de relevancia. Investigando la pH-dependencia de esta reacción enzimática, encontramos que la /V-terminal no protonizada fue esencial para la ciclización de Gln -péptidos y de acuerdo al valor pKa del sustrato fue idéntico al valor pKa para la catálisis de QC (véase Figura 17). De esta manera, QC estabiliza el ataque nucleofílico intramolecular de la porción -amino no protonizada sobre el carbono ?-carbonilo electrofílicamente activado por amidación (Esquema 1 ). En contraste a la carga monovalente presente en los péptidos que contienen glutamina de N-terminal, el Glu-residuo de N-terminal en los péptidos que contienen Glu se carga predominantemente de manera bivalente alrededor del pH neutral. El glutamato muestra los valores pKa de aproximadamente 4.2 y 7.5 para la porción a-amino e y-carboxílica, respectivamente. Es decir, en el pH neutral y anterior, a pesar de que el nitrógeno a-amino no se protoniza en parte o completamente y es nucleofílico, el grupo ?- carboxílico no se protoniza, y así no se ejerce actividad de carbonilo electrofílico. De allí, la ciclización intramolecular es imposible. Sin embargo, en el rango de pH de aproximadamente 5.2- 6.5 entre sus valores pKa respectivos, los dos grupos funcionales se presentan ambos en formas no iónicas, en concentraciones de aproximadamente 1 -1 0% (-NH2) o 1 0- 1 % (-COO H) de péptido que contiene Glu de /V-terminal total. Como resultado, sobre un rango de pH medianamente ácido se presentan las especies de Glu-péptidos de /V-terminal los cuales llevan ambos grupos cargados, y, por lo tanto, es posible que la QC pudiera estabilizar el intermediario de ciclización intramolecular en pGlu-péptido. Es decir, si el grupo ?-carboxílico se protoniza, el carbono de carbonilo es lo suficientemente electrofílico para perm itir el ataque nucleofílico por el grupo a-amino no protonizado. En este pH, el ión hidrófilo funciona como un grupo de salida (Esquema 3). Estos supuestos se corroboran por los datos de dependencia de pH obtenidos para la conversión catalizada por QC de Glu- 3NA (véase ejemplo 1 1 ) . En contraste a la conversión de glutamina de Gln- ?NA por QC, el pH-óptimo de catálisis cambia al rango ácido aproximadamente pH 6.0, es decir, el rango de pH , en el cual las especies de molécula de sustrato son simultáneamente abundantes llevando un grupo a-amino no protonizado y ?-carboxilo protonizado. Además, el valor pKa cinéticamente determinado de 7.55 + 0.02 es un acuerdo excelente con aquel del grupo a-amino de Glu-ß??, determinado por concentración (7.57 + 0.05) .

Fisiológicamente, en pH 6.0 la constante de tasa de segundo orden (o constante de especificidad, kcat/KM) de la ciclización de glutamato catalizado por QC podría encontrarse en el rango de 8.000 veces más lento que el de para la ciclización de glutamina (Figura 1 7). Sin embargo, el cambio no enzimático de ambos sustratos modelo Glu-/?NA y Gln- 7NA es insignificante, siendo conforme con la formación de pGlu-péptido insig nificante observada en la presente invención . De allí, para la pGlu-formación por QC una aceleración de al menos 1 08 puede estimarse de la proporción de las constantes de tasa enzimática contra no enzimática (en comparación a las constantes de tasa de segundo orden para la catálisis de enzima con las constantes de tasa de primer orden de ciclización no enzimática respectiva, el factor de habilidad catalítica es 109-101 0 M"1 para la Gln- y la Glu-conversión, respectivamente) . La conclusión de estos datos es que ¡n vivo solamente una trayectoria enzimática que da como resultado las formaciones de pGlu parece concebible. Ya q ue QC es altamente abundante en el cerebro y que toma en cuenta la tasa de alto cam bio de 0.9 m in"1 recientemente encontrada para la madración de 30 µ? de péptido tipo (Gln)-TRH (Prokai, L , Prokai-Tatrai, K. , Ouyang , X. , Kim, H. S. , Wu , W. M . , Zharikova, A. , y Bodor, N. ( 1 999) J Med Chem 42, 4563-4571) , uno puede pronosticar una vida media de ciclización de aproximadamente 100 horas para un sustrato de glutamato adecuado, se proporcionaron condiciones de reacción similares. Además, dado el compartimiento y localización de QC/EC de cerebro en la trayectoria secretora, la enzima in vivo actual y las concentraciones , de sustrato y las condiciones de reacción podrían aún ser más favorables para la ciclización enzimática en la célula intacta. Y, si el Glu de N-terminal se transforma en Gln una formación de pGlu mucho más rápida mediada por QC podría esperarse , ¡n Vitro, ambas reacciones se suprimieron al aplicar los inhibidores de la actividad de QC/EC (Figuras 9, 1 0 y 15) . En resumen, la presente invención muestra q ue la QC humana, que es altamente abundante en el cerebro, probablemente es un catalizador para la formación de los péptidos pGlu-?ß amiloidogénicos de los precurores Glu-?ß y Gln-?ß, los cuales componen más del 50% de los depósitos de placa encontrados en la Enfermedad de Alzheimer. Estos descubrim ientos identifican a la QC/EC como un jugador en la formación de placas seniles y de esta manera como un nuevo fármaco objetivo en el tratamiento de Enfermedad de Alzheimer. En una segunda modalidad de la presente invención, se encontró que los péptidos derivados de amiloide ß son un sustrato de peptidasa de dipeptidilo IV (DP IV) o enzimas tipo DP IV, preferentemente peptidasa de dipeptidilo I I (DPII). DP IV, DP I I u otras enzimas tipo DP IV liberan un dipéptido de la N-terminal del péptido-ß am iloide modificado (1 -1 1 ) generando el ß-péptido amiloide (3-1 1 ) con g lutamina como el residuo aminoácido de N-terminal. Los resultados se muestran en el ejemplo 8.

Antes de la división por DP II, DPIV u otras enzimas tipo DP IV, el enlace de péptido entre el ácido aspártico (residuo 1 del ß- péptido amiloide) y alanina (residuo 2 de ß-péptido amiloide) puede isomerizarse produciendo un residuo de isoaspartilo según se describe en la literatura (Kuo, Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237, 188-191; S imizu, T. , Watanabe, A., Ogawara, M., Morí, H. and Shirasawa, T. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381 ,225-234). Estos residuos de isoaspartilo vuelven el ß-péptido amiloide resistente contra la degradación de aminopeptidasa y por consecuencia las placas de núcleo contienen altas cantidades de ß-péptidos isoAsp1-amiloide, lo cual sugiere un cambio reducido en la N-terminal. Sin embargo, en la presente invención se demuestra por primera vez, que el dipéptido de N-terminal H-isoAsp -Ala2-OH puede liberarse por peptidasas de dipeptidilo especialmente bajo condiciones ácidas. Además, se mostró que la isomerización puede preceder también la división por ß-secretasa, y que la isomerización puede acelerar el procesamiento proteolítico, conduciendo de esta manera a la liberación de un enlace de isoaspartilo de N-terminal de ß-péptidos isoAsp1-amiloide que subsecuentemente es un sujeto para cambiar por DP II, DPIV o enzimas tipo DP IV Momand, J. and Clarke, S. (1987) Biochemistry 26, 7798- 7805; Kuo, Y.-M., Emmerling, M. R., Woods, A. S., Cotter, R. J., Roher, A. E. (1997) BBRC 237, 188-191). De acuerdo con lo anterior, la inhibición de formación de isoaspartilo puede conducir a la reducción de división por ß-secretasa y, a su vez, a una formación reducida de ß-péptidos amiloide. Además, el bloqueo del cambio de ß-péptido isoAsp -amiloide por inhibición de DP II , DPIV o enzimas tipo DP IV podría prevenir la exposición de [T??3]?ß a la formación catalizada por QC/EC de [pGlu3]Ap. En una tercera modalidad de la presente invención, una combinación de inhibidores de actividad de DP IV y de inhibidores de QC puede utilizarse para el tratamiento de enfermedad de Aízheimér y Síndrome de Down. El efecto combinado de DP IV y/o enzimas tipo DP IV y de QC se ilustra como sigue: a) DP IV y/o enzimas tipo DP IV dividen ?ß(1 -4074.2), un dipéptido que comprende H-Asp-Ala-OH y ?ß((3- 40/42)) se liberan, b) en una reacción secundaria, QC cataliza la ciclización de ácido glutámico en ácido piroglutámico a tasas muy bajas, c) el ácido glutámico se convierte en glutamina en la N-terminal de manera post-translacional por una actividad enzimática desconocida y subsecuentemente, QC cataliza la ciclización de glutamina en ácido piroglutámico después del procesamiento de la N-terminal de ß-péptido amiloide, d) el ácido glutámico se convierte en glutamina de manera post-translacional por un análisis químico o autocatálisis y en una seg unda etapa, QC cataliza la ciclización de glutamina en ácido piroglutámico después del procesamiento de la N-terminal de ß- péptido amiloide, e) Existen mutaciones en el gen APP, que codifican la ß-proteína amiloide, conduciendo a Gln en lugar de Glu en posición 3 de ?ß. Después de la traducción y procesamiento de la N-terminal , QC cataliza la ciclización de glutamina en ácido piroglutámico, f) La glutamina se incorpora en la cadena de péptido naciente de APP, debido a la mal funcionamiento de una actividad enzimática desconocida y subsecuentemente, QC cataliza la ciclización de glutamina de N-terminal en ácido pirog lutámico después del procesamiento de la N-term inal de ß- péptido amiloide. La Gln-exposición de N-terminal a actividad de QC puede también desencadenarse por diferentes actividades de peptidasa. Las aminopeptidasas pueden remover secuencialmeníe Asp y Ala de la N-terminal de ?ß-((1 -40/42)) , desenmascarando de esta manera el aminoácido tres que está propenso a la ciclización. Las peptidasas de dipeptidilo, tales como DP 1 , DP I I, DP IV, DP 8, DP 9 y DP 1 0, remueven el dipéptido Asp-Ala en una etapa. De allí, la inhibición de actividad de am inopeptidasa o dipeptidilpeptidasa es útil para prevenir la formación de ?ß(((3-40/42)).) El efecto combinado de inhibidores de DP IV y enzimas tipo DP IV y de los efectores de disminución de actividad de QC se ilustra en la siguiente manera: a) Los inhibidores de DP VI y/o enzimas tipo DP IV inhiben la conversión de ?ß(1 -40/42) a ?ß((3- 40/42)). b) Una exposición de N-terminal de ácido glutámico se previene de tal modo y la no conversión en glutamina, ya sea por catálisis enzimática o química, subsecuentemente conduciendo a la formación de ácido piroglutámico, es posible. c) Los inhibidores de QC previenen además la formación de ácido piroglutámico de cualquiera de las moléculas de ?ß((3-40/42)) modificadas residuales y aquellas moléculas ?ß((3-40/42)) modificadas, las cuales se generan por mutaciones del gen APP. Dentro de la presente invención, una acción combinada similar de DP IV o enzimas tipo DP IV y QC se demostró para las hormonas de péptido adicionales, tales como glucagon, quimioquinas CC y sustancia P. El glucagon es un polipéptido de 29 aminoácidos liberado de células alfa de isleta pancreática que actúa para mantener la euglícemia al estimular la glicogenolisis hepática y gluconeogénesis.

A pesar de su importancia, permanece la controversia acerca de los mecanismos responsables para el despeje de g lucagon en el cuerpo. Pospisilik ef al. , valoraron el metabolismo enzimático de glucagon utilizando técnicas espectrométricas en masa sensible para identificarlos productos moleculares. La incubación de glucagon con peptidasa de dipeptidilo IV de porcino purificado (DP IV) produjo la producción secuencial de glucagon(3-29), y glucagon (5-29). En suero humano, la degradación a glucagon(3-29) se siguió rápidamente por la ciclización de N-terminal de glucagon, previniendo además la hidrólisis mediada por DP IV. El bioensayo de glucagon , siguiente a la incubación con DP IV purificada o suero de rata normal demostró una pérdida significante de actividad hiperglicémica , mientras que la incubación similar en el suero de rata deficiente de DP IV no mostró ninguna pérdida de bioactividad de glucagon. La degradación, monitoreada por espectrometría de masa y bioensayo, se bloqueó por el inhibidor de DP IV específico, tiazolidina de isoleucilo. Estos resultados identifican DP IV como una enzima primaria incluida en la degradación e inactivación de glucagon . Estos descubrimientos tienen importantes implicaciones para la determinación de niveles de glucagon en plasma humano (Pospisilik et al. , Regul Pept 2001 Jan 12; 29(3): 133-41 ). La Proteína Quim iotáctica de Monocito Humano (MCP)-2 orig inalmente se ha aislado de células de osteosarcoma estimuladas como una quimioquina producida con MCP-1 y CP-3. Von Collie ef al. (Van Coillie, E. et al. 1 998 Blochemistry 37, 12672-12680) clonaron un cADN de MCP-2 extendido de extremo 5' de una biblioteca de cADN de testículo g rado . Esta codificó una proteína de MCP-2 de 76 residuos, pero difirió de la secuencia de cADN de MCP-2 derivada por médula ósea reportada en codón 46, la cual se codificó para un Lys en lugar de un Gln. Esta variante de MCP-2Lys46, originada por un polimorfismo de n ucleótido único (SNP) , se comparó biológicamente con MCP-2Gln46. Las reg iones de codificación se sub-clonaron en el vector de expresión bacteriana pHEN 1 , y después de la transformación de Escheríchia coli, las dos variantes de proteína MCP-2 se recuperaron del periplasma. La degradación de Edman reveló un residuo Gln en la terminal NH2 en lugar de pGlu. rMCP-2Gln46 y rMCP-2Lys46 y las contrapartes cíclicas de terminal NH2 se probaron sobre células monolíticas en movilización de calcio y ensayos de quimiotaxis. No se observó diferencia significante en la actividad biológica entre las ¡soformas rMCP-2Gln46 y rMCP-2Lys46. Sin embargo, para ambas variantes de MCP-2 el pirog lutamato de terminal NH2 se mostró que era esencial APRA la quimotaxis, pero no para la movilización de calcio, la truncación de term inal NH2 de rMCP-2Lys46 por la proteasa de serina CD26/peptidasa de dipeptidilo IV (CD26/DPP IV) dio como resultado la liberación del dipéptido Gln-Pro de terminal N H2, m ientras que MCP-2 sintético con un pGlu de terminal amino permaneció sin afectar. rMCP-2Lys46(3-76) sujetado por CD26/DPP IV fue casi completamente inactivo en ambos ensayos de señalización y quimiotaxis. Estas observaciones indicaron que el pGlu de terminal N H2 en MCP-2 es necesario para la actividad quim otáctica pero también protege la proteína contra la degradación por CD26/DPP IV (van Coillie, E. et al. , Biochemistry 1 998 37, 12672- 80) . Dentro de la presente invención , se determinó por análisis LC/MS que la formación del residuo de piroglutamato de N-terminal determinada en g lucagon(3-29) (Pospisilik ef al. , 2001 ) y en ¡soformas MCP-2 (van Coillie, ef al. , 1 998), se cataliza por QC. Además, se probó por la investigación de LC/MS que después de que la remoción catalizada por DP IV de N-terminal de los dos dipéptidos Lys-Pro y Arg-Pro de la sustancia P, la [Gln5]sustanciaP5- 1 restante se transforma por QC a [pGlu5]sustanciaP5-1 1 . Los inhibidores de DP IV se describen en WO 99/61431 . En particular, los inhibidores de DP IV se describen comprendiendo un residuo de am inoácido y un grupo pirrolidina o tiazolidina , y sales de los mismos, especialmente tiazolidina de L-treo-isoleucil, tiazolidina L-alo-isoleucil , pirrolidina de L-treo-isoleucil, tiazolidina de L-alo-isoleucil , pirrolidina de L-alo-isoleucil , y sales de las mismas. Los ejemplos adicionales de inhibidores de peptidasa de dipeptidilo IV de bajo peso molecular son agentes tales como derivados de tetrahidroisoquinolin-3-carboamida, 2-cianopirolas N-sustituidas y pirrolidinas, N-(N'-g licil sustituido)-2-cianopirrolidinas, N-(glicil sustituido)-tiazolidinas, N-(glicil sustituido)-4-cianotiazolidinas, amino- y acil-boro-prolil-inhibidores, pirrolidinas ciclopropil-fusionadas y compuestos heterocíclicos. Los inhibidores de peptidasa de dipeptidilo IV se describen en E.U. 6,380,398, E.U. 6,011,155; E.U. 6,107,317; E.U. 6,110,949; E.U. 6,124,305; US 6,172,081; WO 95/15309, WO 99/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 196 16 486 C 2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO 99/38501, WO 99/46272, WO 99/38501, WO 01/68603, WO 01/40180, WO 01/81337, WO 01/81304, WO 01/55105, WO 02/02560 y WO 02/14271, WO 02/04610, WO 02/051836, WO 02/068420, WO 02/076450; WO 02/083128, WO 02/38541, WO 03/000180, WO 03/000181, WO 03/000250, WO 03/002530, WO 03/002531, WO 03/002553, WO 03/002593, WO 03/004496, WO 03/024942 y WO 03/024965, las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad, especialmente concerniente a estos inhibidores, su definición, usos y su producción. Se prefieren para el uso en combinación con efectores de QC los inhibidores de DPIV tales como NVP-DPP728A (1-[[[2-[{5-cianopiridin-2-il}amino]etil]amino]acetil]-2-ciano-(S)-pirrolidina) (Novartis) según se describe por Hughes eí al. 1999 Biochemistry 38 11597-11603, LAF-237 (1 -[(3-hidroxi-adamant-1 -ilamino)-acetil]-pirrolidina-2(S)-carbonitrilo); descrito por Hughes eí al., Meeting of the American Diabetes Association 2002, No. de resumen 272 (Novartis), TSL-225 (ácido triptofil-1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico), descrito por Yamada eí al. 1998 Bioorg Med Chem Lett 8,1537-1540, 2-cianopirrolididas y 4-cianopirrolididas según se describe por Asworth eí al. 1996 Bioorg Med Chem Lett 6, 1163-1166 y 2745-2748, FE-999011, descrito por Sudre eí al. 2002 Diabetes 51, 1461 -1469 (Ferring) y los compuestos descritos en WO 01/34594 (Guilford), empleando dosis según se establece en las referencias anteriores. Los inhibdores de DP IV más preferidos para el uso en combinación con efectores de QC son compuestos de dipéptido en los cuales el aminoácido se selecciona preferentemente de un aminoácido natural, tal como, por ejemplo, leucina, valina, glutamina, ácido glutámico, prolina, isoleucina, asparaginas y ácido aspártico. Los compuestos tipo dipéptido utilizados de acuerdo a la invención muestran a una concentración (de compuestos de dipéptido) de 10 µ?,' una reducción en la actividad de peptidasa de dipeptidilo IV de plasma o actividades de enzima análogos de DPIV de al menos 10%, especialmente de al menos 40%. Frecuentemente una reducción en la activdad de al menos 60% o al menos 70% también se desea in vivo. Los compuestos preferidos también pueden mostrar una reducción en la actividad de un máximo de 20% o 30%. Los compuestos de dipéptido preferidos son prolil N-valil, hidroxilamina de O-benzoil, pirroíidina de alanil, tiazolidina de isoleucil como tiazolidina de L-alo-isoleucil, pirroíidina de L-treo-isoleucil y sales de las mismas, especialmente las sales fumáricas, y pirroíidina de L-alo-isoleucil y sales de la misma. Los compuestos especialmente preferidos son pirroíidina de glutaminil y tiazolidina de glutaminil, H-Asn-pirrolidina, H-Asn-tiazolidina, H-Asp-pirrolidina, H-Asp-tiazolidina, H-Asp(NHOH)-pirrolidina, H-Asp(NHOH)-tiazolidina, H-Glu-pirrolidina, H-Glu-tiazolidina, H-Glu(NHOH)-pirrolidina, H- GIu(NHOH)-tiazol¡dina, H-His-pirrolid¡na, H-His-tiazolidina, H-Pro- pirrolidina, H-Pro-tiazolidina, H-lle-azididine, H-Ile-pirrolidina, H-L-alo- lle-tiazolidina, H-Val-pirrolidina y H-Val-tiazolidina y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Estos compuestos se describen en WO 99/61431 y EP 1 304 327. Además, la presente invención se proporciona para el uso de efectores de QC en combinación con compuestos de péptido tipo sustrato útiles para la modulación competitiva de catálisis de peptidasa de dipeptidilo IV. Los compuestos de péptido preferidos son 2-ácido amino octanoico-Pro-lle, Abu-Pro-lle, Aib-Pro-lle, Aze-Pro-lle, Cha-pro-lle, lle-Hyp-lle, lle-Pro-al/o-lle, lle-Pro-t-butyl-Gly, lle-Pro-Val, Nle-Pro-lle, Nva-Pro-lle, Orn-Pro-lle, Phe-Pro-lle, Phg-Pro-lle, Pip-Pro-lle, Ser (Bzl)-Pro-lle, Ser(P)-Pro-lle, Ser-Pro-lle, t-butil-Gly-Pro-D-Val, t-butil-Gly-Pro-Gly, t-butil-Gly-Pro-lle, t-butil-Gly-Pro-lle-amida, t-butil-Gly-Pro-t-butil-Gly, t-butil-Gly-Pro-Val, Thr-Pro-lle, Tic-Pro-lle, Trp-Pro-lle, Tyr(P)-Pro-lle, Tyr-Pro-allo-lle, Val-Pro-allo-lle, Val-Pro-f-butil-Gly, Val-Pro-Val y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde t-butil-Gly se define como y Ser(Bzl) y Ser(P) se definen como bencil-serina y fosforil-serina, respectivamente. Tyr(P) se define como fosforil-tirosina. Estos compuestos se describen en WO 03/002593. Los inhibidores de DP IV preferidos adicionales, los cuales pueden utilizarse de acuerdo a la presente inención en combinación con efectores de QC, son peptidilcetonas, por ejemplo, · hidrobromuro de 2-Metilcarbonil-1 -N-[(L)-Alanil-(L)- Valinil]-(2S)-pirrolidina, hidrobromuro de 2-Metil)carbonil-1 -N-[(L)-Valinil-(L)-Prolyl-(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidina, • hidrobromuro de 2-[(Acet¡l-oxi-metil)carbonil]-1 -N-[(L)-Alanil-(L)-Valinil]-(2S)-pirrol¡dina, · hidrobromuro de 2-[Benzoil-oxi-metil)carbonil]-1 -N- [{(L)-Alanil}-(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidina, • 2-{[(2,6-Diclorbencil)tiometil]carbonil}-1 -N-[{(L)-Alanil}-(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidina, • hidrobromuro de 2-[Benzoil-oxi-metil)carbonil]-1 -N-[Glicil-(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidina, • trifluoracetato de 2-[([1 ,3]-Tiazoltiazol-2-il)carbonil]-1-N-[{(L)-Alanil}-(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidina, • trifluoracetato de 2-[(Benzotiazoltiazol-2-il)carbonil]-1 -N-[N-{(L)-Alanil}-(L)-Valinil]-(2S)-pirroüdin, · trifluoracetato de 2-[(-Benzotiazolt¡azol-2-il)carbonil]-1 -N-[{(L)-Alanil}-Glicil]-(2S)-pirrolidina, • trifluoracetato de 2-[(Piridin-2-il)carboniI]-1 -N-[N-{(L)-Alanil}-(L)-Valinil]-(2S)-pirrolidina y otras sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Estos compuestos se describen en WO 03/033524.

Además, de acuerdo a la presente invención las aminocetonas sustituidas pueden utilizarse en combinación con los efectores de QC. Las aminocetonas sustituidas preferidas son: • cloruro de 1 -ciclopentil-3-met¡l-1 -oxo-2-pentanamonio, • cloruro de 1 -ciclopentil-3-metil-1 -oxo-2-butanamonio, • cloruro de 1 -ciclopentil-3,3-dimetil-1 -oxo-2-bútanaminio, · cloruro de 1 -ciclohexil-3,3-dimetil-1 -oxo-2-butanainio, • cloruro 3-(ciclopentilcarbonil)-1 ,2,3,4-tetrahidroisoquinolinio, • cloruro de A/-(2-ciclopentil-2-oxoetil)ciclohexanaminio y otras sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Entre el grupo raro de proteasas específicas de prolina, originalmente se creyó que DP IV ers la única enzima unidad por membrana específica para la prolina como el residuo penúltimo en la terminal aminoi de la cadena de polipéptido. Sin embargo, otras moléculas, aún aquellas estructuralmente no homologas con la DP IV pero que llevan la actividad de enzima correspondiente, se han identificado. Las enzimas tipo DP IV, que se han identificado hasta ahora, incluyen por ejemplo, proteína de activación de fibroblasto a, peptidasa de dipeptidilo IV ß, la proteína tipo aminopeptidasa de dipeptidilo, dipeptidasa acida a-unida N-acetilada, dipeptidasa de prolina de célula estática, peptidasa de dipeptidilo I I , atractiva y peptidasa de dipeptidilo IV, proteína relacionada (DPP 8), DPL1 (DPX, DP6) , DPL2 y DPP 9 descritas en artículos de revisión por Sedo & Malik (Sedo y Malik 2001 , Biochlm Biophys Acta , 36506, 1 -10) y Abbott and Gorrell (Abbott, C. A. y Gorrell , M. D. 2002 I n: Lang ner & Ansorge (ed.), Ectopeptidases . Kluwer Academ ic/Plen um Publishers, New York, 1 71 - 1 95) . Recientemente, la clonación y caracterización de peptidasa de dipeptiilo 1 0 (DPP 1 0) se reportó (Q¡, S. Y. et al. , Biochem ical Journal Im mediate Publication . Publicada el 28 de marzo de 2003 coom un man uscrito BJ20021 914). Los efectores, como aquel término que se utiliza en la presente, se definen como moléculas que se unen a las enzimas y aumentan o reducen su actividad in Vitro y/o in vivo. Algunas enzimas tienen sitios de unión para moléculas pequeñas que afectan su actividad catalítica; una molécula estimuladora se llama un accionador. Las enzimas pueden aún tener m últiples sitios para reconocer más de un accionador o inhibidor. Las enzimas peuden detectar concentraciones de una variedad de moléculas y utilizar esa inform ación para variar sus propias actividades. Los efectores pueden modular la actividad enzimática debido a que las enzimas pueden asumir tanto conformaciones activas como inactivas: los accionadores son efectores positivos, los inhibidores son efectores negativos. Los efectores actúan no solamente en los sitios activos de enzimas , sino tam bién en sitios reguladores, o sitios alostéricos, términos utilizados para enfatizar que el sitio regulador es un elemento de la enzima distinto del sitio catalítico y para diferenciar esta forma de regulación de competencia entre los sustratos y los inhibidores en el sitio catalícito (Damell, J. , Lodish, H y Baltimore, D. 1990, Molecular Cell Biology 2nd Edition, Scientific American Books, Nueva Yor, página 63). Los efectores preferidos de acuerdo a la presente invención son inhibidores de actividad QC y EC. Los más preferidos son los inhibidores competitivos de la actividad de QC y EC. En donde es adecuado, los activadores de actividad QC y EC se prefieren. En los péptidos de la presente invención, cada residuo aminoácido se representa por una designación de una letra o de tres letras, correspondiente al nombre trivial del aminoácido, de acuerdo con la siguiente lista convencional: Aminoácido Símbolo de Una Letra Símbolo de Tres Letras Alanina Arginina Asparagina Ácido aspártico Cisteína Glutamina Ácido glutámico Glicina Histidina Isoleucina 1 lie Leucína L Leu Usina Lys etionina M et Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofan w Trp Tirosina Y Tyr Valina V Val El término "QC" según se utiliza en la presente comprende ciclasa de glutaminil (QC) y enzimas tipo QC. QC y las enzimas tipo QC tienen actividad enzimática similar o idéntica, además definida como actividad QC. En este aspecto, las enzimas tipo QC pueden fundamentalmente diferir en su estructura molecular de QC. El término "actividad QC" según se utiliza en la presente se define como ciclización intramolecular de residuos de glutamina de N-terminal en ácido piroglutámico (pGlu*) o de L-homoglutamina de N-terminal o L-p-homoglutamina a un derivado de piro-homoglutamina cíclica bajo liberación de amonio. Véanse por lo tanto los esquemas 1 y 2.

Esquema 1 : Ciclización de glutamina por QC péptido Esquema 2: Ciclización de L-homoglutamina por QC péptido El término "QC" según se utiliza en la presente comprende la actividad secundaria de QC y las enzimas tipo QC como ciclasa de glutamato (EC) , definida además como actividad EC. El término "actividad EC" según se utiliza en la presente se define como ciclización intramolecular de residuos de glutamato de N-terminal en ácido piroglutámico (pGlu*) por QC. Véase por lo tanto Esquema 3. El término "enzima dependiente de metal" según se utiliza en la presente se define como enzima (s) que requieren un ión metálico unido a fin de satisface su función catalítica y/o requieren un ión metálico unido a fin de formar la estructura catalíticamente activa.

Esquema 3: Ciclización de N-terminal de péptidos de glutamil no cargados por QC (EC) Otro aspecto de la presente inención es la identificación de nuevos sustratos fisiológicos de QC. Estos se identificaron al realizar experimentos de ciclización con péptidos de mamífero según se describe en el ejemplo 5. Antes, la QC humana y QC de papaya se aislaron según se describe en el ejemplo 1. Los métodos aplicados se describen en el ejemplo 2, y la síntesis de péptido empleada se señala en el ejemplo 6. Los resultados del estudio se muestran en la Tabla 1 .

Tabla 1 : Nuevos sustratos fisiológicos de ciclasa de glutaminil Todos los análisis se realizaron en el rango óptimo de la actividad y estabilidad ya sea de QC de planta o humano, según se demuestra en el ejemplo 4. Las secuencias de aminoácidos de péptidos fisiológicos activos que tienen un residuo de glutamina de N-terminal y que son por lo tanto sustratos para la enzima QC se enlistan en la Tabla 2: Tabla 2: Secuencias de aminoácido de péptidos fisiológicos activos con un residuo de glutamina de N-Terminal, que se convierte de manera post-translacional en ácido piroglutámico (pGlu) Péptido Secuencia de Función aminoácido Prot-Suizo: P01350 QGPWL La gastrina estimula la EEEEEAYGWM DF mucosa estomacal para (amida) producir y secretar ácido hidroclórico y el páncreas para secretar sus enzimas digestivas. También estimula la contracción de músculo liso y aumenta la circulación sanguínea y secreción de agua en el estómago e intestino.

Neurotensina QLYENKPRRP YI L La neurotensina juega un papel paracrino o Prot-Suizo: P30990 endocrino en lar gulación de metabolismo de grasa. Origina la contracción del músculo liso FPP Amida QEP Un tripéptido relacionado a hormona liberadora de tirotrofina (TRH) , se encuentra en plasma seminal. La evidencia reciente obtenida in vitro e in vivo mostró que FPP juega un papel importante en regular la fertilidad de esperma.

TRH Amida QH P La TRH funciona como un regulador de la Prot-Suizo: P:20396 biosíntesis de TSH en la glándula pituitaria anterior y como un neurotransmisor/ neuromodulador en los sistemas nerviosos periféricos y centrales.

GnRH Amida QHWSYGL Estim ula la secreción RP(G) de gonadotropinas: Prot-Suizo: P01 148 estimula la secreción tanto de hormonas estimuladoras de folículo y luteinizante.

CCL 1 6 (pequeña QPKVPE Muestra actividad VNTPSTCCLK q uimiotáctica para citoquina inducible YYEKVLPRRL linfocitos y monocitos VVGYRKALNC pero no neutrófilos . A1 6) HLPAI I FVTK También muestra RNREVCTNPN actividad DDWVQEYIKD m ielosupresora potente, PN LPLLPTRN suprime la proliferación LSTVKI ITAK de células progenitoras NGQPQLLNSQ de mieloide. SCYA1 6 recombinante muestra actividad quimotáctica para monocitos y THP-1 monocitos, pero no para disminuir linfocitos y neutrófilos . Induce un flujo de calcio en células THP- 1 que se desensibilizaron por expresión anterior a RANTES.

Fractalquina AH HGVT La forma soluble es KCNITCSKMT quimiotáctica para las (neurotactina) SKIPVALLI H células T y monocitos, YQQNQASCGK pero no para neutrófilos.

Prot-Suizo: P78423 PvAH LETRQH La forma unida por RLFCADPKEQ membrana promueve la WVKDAMQH LD adhesión de aquellos RQAAALTRNG leucocitos a células GTFEKQIGEV endoteliales. Puede KPRTTPAAGG jugar un papel en MDESVVLEPE regular procesos de ATG ESSSLEP migración y adhesión de TPSSQEAQRA leucocito en el LGTSPELPTG endotelio. Se une a VTGSSGTRLP cx3cr1 . PTPKAQDGGP VGTELFRVPP VSTAATWQSS APHQPGPS LW AEAKTSEAPS TQDPSTQAST ASSPAPEENA PSEGQRVWGQ GQSPRPENSL EREEMGPVPA HTDAFQDWGP GSMAHVSVVP VSS EGTPSRE PVASGSWTPK AEEPI HATMD PQRLGVLITP VPDAQAATRR QAVGLLAFLG LLFCLGVAMF TYQS LQGCPR KMAGEMAEGL RYI PRSCGSN SKYVLVPV CCL7 (pequeña QPVGINT El factor quimiotáctico STTCCYRFI N que atrae monocitos y citoquina inducible KKI PKQRLES eosinofilos, pero no YRRTTSSHCP neutrofiios. Aumenta la A7) REAVI FKTKL actividad anti-tumoral DKEICADPTQ monocito También Prot-Suizo: P80098 KWVQDFMKHL induce la liberación de DKKTQTPKL gelatinasa B. Esta proteína puede unir la heparina. Se une a CCR1 , CCR2 y CCR3.

Orexina A QPLPDCCRQK El neuropéptido que TCSCRLYELL juega un papel (Hipocretin-1 ) Prot- HGAGN HAAG I LTL im portante en la regulación de toma Suizo : 043612 alimenticia e insomnio, posiblemente al coordinar el comportamiento complejo y respuestas fisiológicas de estas funciones homeostáticas complementarias. Juega también un papel más amplio en la regulación homeostática de metabolismo de energ ía, función autónoma, balance hormonal y la regulación de fluidos corporales. La orexina A se une tanto a OX1 R como OX2R con una alta afinidad. Sustancia P RPK PQQFFGL Pertenece a taquiquininas. Las taquiquinas son péptidos activos que excitan las neuronas, provocan respuestas de comportamiento, son vasodilatadores potentes y secretagogos, y contraen (directamente o indirectamente) varios músculos lisos .

En una cuarta modalidad, los péptidos [Gln1]Gastrina (17 y 34 aminoácidos en longitud), [Gln1]Neurotensina y [Gln1]FPP se identificaron como nuevos sustratos fisiológicos de QC. Gastrina, Neurotensina y FPP comprenden un residuo pGlu en su posición de N-terminal. Este residuo pGlu de N-terminal se mostró que se formó de glutamina de N-terminal por catálisis de QC para todos los péptidos. Como resultado, estos péptidos se activan en términos de su función biológica en la conversión del residuo de glutamina de N-terminal a pGlu. Las células transductoras transepiteliales, particularmente la célula gastrina (G), coordinan la secreción de ácido gástrico con la llegada de alimentos en el estómago. El trabajo reciente mostró que múltiples productos activos se generan del precursor de gastrina, y que existen múltiples puntos de control en biosíntesis gástrica. Los precursores biosíntéticos e intermediarios (progastrina y Gly-gastrinas) son factores de crecimiento putativos; sus productos, las gastrinas amidadas, regulan la proliferación de célula epitelial, la diferenciación de células parietales productoras de ácido y células tipo enterocromafina secretoras de histamina (ECL), y la expresión de genes asociados con síntesis de histamina y almacenamiento en células ECL, así como también la secreción de ácido agudamente estimulador. Gastrina también estimula la producción de miembros de la familia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) , los cuales a su vez inhiben la función de célula parietal pero estimulan el crecimiento de células epiteliaes de superficie. Las concentraciones de gastrina de plasma se elevan en sujetos con Helicobacter pylori, q uienes se conocen po tener riesgo aumentado de enfermedad de úlcera duodenal y cáncer gástrico (Dockray, G.J . 1 989 J Physio! 1 5 315- 324). La hormona péptida gastrina, liberada de células G antrales, se conoce por estimular la síntesis y liberación de histamina de células ECL en la mucosa oxíntica por medio de receptores CCK-2. La histamina movilizada induce a dicha secreción de ácido al unirse a los receptores H(2) ubicados en las células parietales. Recientes estudios sugieren que la gastrina, tanto en sus formas menos procesadas como completamente amidadas (progastrina y gastrina extendida por glicina) , es también un factor de crecimiento para el tracto gastrointestinal . Se ha establecido que el efecto trófico principal de gastrina amidada es para la mucosa oxíntica de estómago, en donde se origina la proliferación aumentada de células germinales gástricas , dando como resultado la masa de célula ECL y parietal aumentada. Por el otro lado, el objetivo trófico principal de la gastrina menos procesada (por ejem plo, gastrina extendida por glicina) parece que es la m ucosa colónica (Koh, T.J . y Chen. D. 2000 Regul Pept (337-44). En una quinta modalidad, la presente, invención proporciona el uso de efectores aumentadores de actividad de QC para la estim ulación de proliferación de cél ula de tracto gastrointestinal , especialmente proliferación de célula mucosal gástrica, proliferación de célula epitelial, la diferenciación de células parietales productoras de ácido y células tipo enterocromafina secretoras de histamina (ECL) , y la expresión de genes asociados con síntesis de histamina y almacenamiento en células ECL, así como también para la estim ulación de secreción de ácido ag udo en mamíferos al mantener o aumentar la concentración de [pGlu1]-gastrina activa. En una sexta modalidad, la presente invención proporciona el uso de efectores reductores de actividad de QC para el tratamiento de enfermedad de úlcera duodenal y cáncer gástrico con c/o Heliobacter pylori en mamíferos al reducir la tasa de conversión de [Gln1]gástrica inactiva para activar [pGlu1]Gastrina. La neurotensina (NT) es un neuropéptido implicado en la patofisiología de esquizofrenia que . específicamente modula los sistemas neurotransmisores previamente demostrados por regularse mal en este desorden. Los estudios clínicos en los cuales las concentraciones NT de fluido cerebroespinal (CSF) se han medido, revelaron un subgrupo de pacientes esquizofrénicos con concentraciones NT de CSF reducido que se volvieron a almacenar por tratamiento de fármaco anti-psicótico eficaz. La evidencia considerable también existe concordante con la inclusión de sistemas NT en el mecanismo de acción de fármacos anti-psicóticos. Los efectos bioquímicos y de comportamiento de NT administrado centralmente notablemente se asemejan a aquellos de fármacos anti-psicóticos sistémicamente administrados, y los fármacos anti-psicóticos aumentan la neurotransmisión de NT. Esta concatenación de descubrimientos conducen a la hipótesis de que NT funciona como un anti-psicótico endógeno. Además, los fármacos antipsicóticos atípicos y típicos diferencialmente alteran la neurotransmisión NT en regiones terminales de dopamina mesolím bica y nigrostriatal , y estos efectos son de predicción de confiabilidad y eficacia de efecto secundario, respectivamente (Binder, E. B. et al. , 2001 Biol Psychiatry 50 856-872) . En una séptima modalidad, la presente invención proporciona el uso de efectores aumentadores de actividad de QC para la preparación de fármacos anti-psicóticos y/o para el tratamiento de esquizofrenia en mam íferos. Los efectores de QC ya sea mantienen o aumentan la concentración de [pGlu1]neurotensina activa . El péptido promotor de fertilización (FPP) , un tripéptido relacionado a la hormona liberadora de tirotrofina (TRH), se encuentra en el plasma seminal. Reciente evidencia obtenida in Vitro e ¡n vivo mostró que FPP juega un papel im portante en la regulación de la fertilidad de esperma . Específicamente, FPP inicialmente estimula el espermatozoide (no capacitado) no fertilizante se "encienda" y llegue a ser más rápidamente fértil, pero después dism inuye la capacitación de tal forma que los espermatozoides no superan la pérdida de de acromosoma espontánea y por lo tanto no pierden el potencial fertilizante. Estas respuestas se imitan , y a su vez se aumentan , por adenosina, conocida por regular la trayectoria de transducción de señal de ciclasa adenilil (AC)/cAMP. Tanto FPP como adenosina se ha mostrado que estimulan la producción de cAMP en células no capacitadas pero la inhiben en células capacitadas, con receptores FPP de alguna forma interactuando con receptores de adenosina y proteínas G para lograr la regulación de AC. Aquellos casos afectan el estado de fosforilación de tirosina de varias proteínas, algunas siendo importantes en el "encendido" inicial, otras posiblemente incluyéndose en la reacción de acromosoma por sí misma. Calcitonina y angiotensina I I , también encontradas en plasma seminal, tienen efectos similares in Vitro en espermatozodes no capacitados y pueden aumentar respuestas a FPP. Estas moléculas tienen efectos similares in vivo, afectando la fertilidad al estimular y después mantener el potencial fertilizante. Cualquiera de las reducciones en la disponibilidad de FPP, adenosina, calcitonina, y angiotensina I I o defectos en sus receptores contribuyen a la infertilidad masculina (Fraser, L.R. y Adeoya-Osiguwa, S.A. 2001 Vitam Horm 63, 1 -28). En una octava modalidad, la presente invención proporciona el uso de efectores de disminución de actividad de QC para la preparación de fármacos prohibitivos de fertilización y/o para reducir la fertilidad en mamíferos. Los efectores de disminución de actividad de QC reducen la concentración de [pGlu1]FPP activo, conduciendo a una prevención de capacitación de esperma y desactivación de células esperma. En contraste, podía mostrarse que los efectores aumentadores de actividad de QC son capaces de estimular la fertilidad en hombres y tratar la infertilidad. En una novena modalidad, los sustratos fisiológicos adicionales de QC se identificaron dentro de la presente invención. Estos son [Gln1]CCL2, [Gln1]CCL7, [Gln ]CLL8, [Gln1]CCL16, [Gln ]CCL1 8 y [Gln1]fractalquina. Para detalles véase la Tabla 2. Estos polipéptidos juegan un papel importante en condiciones patofisiológicas, tales como supresión de proliferación de células progenitoras de mieloide, neoplasia, respuestas huésped inflamatorias, cáncer, psoriasis, artritis reumatoide, aterosclerosis, respuestas de inmunidad mediada por célula y humoral, procesos de migración y adhesión de leucocitos en el endotelio. Varias vacunas basadas en péptido de linfocito T citotóxico contra hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana y melanoma se estudiaron recientemente en ensayos clínicos. Un candidato de vacuna de melanoma interesante solo o en combinación con otros antígenos tumorales, es el decapéptido ELA. Este péptido es un análogo de péptido inmunodominante de antígeno Melan-A/MART-1 , con un ácido glutámico de N-terminal. Se ha reportado que el grupo amino y el grupo gamma-carboxílico de ácidos glutámicos, así como también el grupo amino y grupo gamma-carboxamida de glutaminas, se condensan fácilmente para formar los derivados piroglutámicos. Para superar este problema de estabilidad, varios péptidos de interés farmacéutico se han desarrollado con un ácido piroglutámico en lugar de glutamina de N-terminal o ácido glutámico, sin pérdida de propiedades farmacológicas. Desafortunadamente en comparación con ELA, el derivado de ácido piroglutámico (PyrELA) y también el derivado cubierto por acetilo de N-terminal (AcELA) fallaron en producir actividad de linfocito T citotóxico (CTL) . A pesar de las modificaciones menores aparentes introducidas en PyrELA y AcELA, estos dos derivados probablemente tienen afinidad inferior a ELA para el complejo de histocompatibilidad principal de clase I específico. Por consecuencia, a fin de conservar la actividad completa de ELA, la formación de PyrELA debe evitarse (Beck A. et al. 2001 , J Pept Res 57(6):528-38). Recientemente, se encontró q ue tam bién la enzima ciclasa de glutaminil (QC) se sobreexprsa en melanomas (Ross D . T eí al. 2000 , Nat Genet 24:227-35) . En una décima modalidad, la presente invención proporciona el uso de efectores de QC para la preparación de un medicamento para el tratam iento de condiciones patofisiológicos, tales como supresión de proliferación de células progenitoras de mieloide, neoplasia, respuestas huésped inflamatorias , cáncer, metástasis malignas , melanoma, psoriasis, artritis reumatoide, aterosclerosis, respuestas de inmunidad medidas por célula y humorales deterioradas, procesos de migración y adhesión de leucocitos en el endotelio y procesos inflamatorios relacionados a la enfermedad de Alzheimer, FBD y FDD. En una onceava modalidad, [Gln ]orexina A se identificó como un sustrato fisiológico de QC dentro de la presente invención. Orexina A es un neuropéptido que juega un papel importante en la regulación de toma alimenticia e insomnio, posiblemente al coordinar las respuestas fisiológicas y de comportamiento com plejo de estas funciones homeostáticas complementarias. También juega un papel en la regulación homeostática de metabolismo de energía, función autonómica, balance hormonal y la regulación de fluidos corporales. En una doceava modalidad, la presente invención proporciona el uso de efectores de QC para la preparación de un medicamento para el tratamiento de toma alimenticia deteriorada e insomnio, regulación homeostática deteriorada de metabolismo de energía, función autonómica deteriorada, balance hormonal deteriorado y regulación deteriorada de fluidos corporales. Las expansiones de poliglutamina en varias proteínas conducen a los desórdenes neurodegenerativos, tales como enfermedad de Parkinson y enfermedad de Kennedy. Por lo tanto, el mecanismo permanece principalmente sin conocer. Las propiedades bioquímicas de repeticiones de poliglutamina sugieren una posible explicación: división endolítica en un enlace de glutaminil-glutaminil seguido por la formación de piroglutamato puede contribuir a la patogénesis a través de aumentar la estabilidad catabólica, hidrofobicidad, amiloidogenlcida, y neurotoxicidad de las proteínas de poliglutamanil (Saido T; Med Hypotheses (2000) Mar; 54(3):427-9). En una treceava modalidad, la presente invención proporciona por lo tanto el uso de efectores de QC para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad de Parkinson y enfermedad de Hungtington. En una catorceava modalidad, la presente invención proporciona una manera general para reducir o inhibir la actividad enzimática de QC. Los ejem plos de compuestos inhibidores también se proporcionan . La inhibición de una QC de mamífero solamente se detectó de manera inicial para 1 , 1 0-fenantrolina y 6-metilpterina reducida (Busby, W. H . J . et al. 1 987 J Biol Chem, 262, 8532-8536) . EDTA no inhibió QC, de esta manera se concluyó que QC no es una enzima dependiente de metal (Busby, W. H. J . et al. 1 987 J Biol Chem 262, 8532-8536 , Bateman , R.C. J . et al. , 2001 Biochemistry 40, 1 1 246-1 1250, Booth , R. E . et al. 2004 BMC Biology 2). En la presente invención , sin em bargo, se muestra que QC humana y otras QCs de animal son enzim as dependientes de metal, según se revela por las características de inhibición de QC por 1 , ?-fenantrolina, ácido dipicolínico, 8-hidroxi-quinolina y otros queladores (Figuras 1 8, 1 9) y por la reactivación de QC por iones de metal de transición (Figura 20) . Finalmente, la dependencia de metal se subraya por una comparación de secuencia a otras enzimas dependientes de metal, mostrando una conservación de los residuos de aminoácido quelante también en QC humana (Figura 21 ). La interacción de los compuestos con el ión metálico unido por sitio activo representa una manera general para reducir o inhibir la actividad de QC. En la presente invención se muestra que los derivados de imidazol son inhibidores potentes de QC. Utilizando el ensayo continuo (para detalles véase el ejemplo 2), varios derivados de imidazol se analizaron en cuanto a su habilidad para inhibir la QC humana como un m iem bro de las QCs de mam ífero altamente conservadas. De esta manera, la presente invención proporciona derivados de imidazol e histidina y sus derivados como efectores reducrtores de actividad de QC y sus características en términos de tipo de inhibición y potencia. Las estructuras y valores K¡ se muestran en las tablas 3 y 4. Los resultados se describen a detalle en el ejemplo 7.

Tabla 3: Constantes Inhibidoras de derivados de imidazol en la reacción catalizada por QC humana. Las determinaciones se realizaron a 30°C en 0.05 M de Tris-HCI pH 8.0, conteniendo 5 mM EDTA.

Compuesto valor K¡ Estructura (mM) Estructuras de núcleo Imidazol 0.103 + Bencimidazol 0.004 0.138 + 0.005 Derivados de N-1 1-bencilimidazol 0.0071 + 1-metilimidazol 0.0003 1-vinilimidazol 0.030 ± Diimizoliduro de ácido oxálico 0.001 N-acetilimidazol 0.049 + N-(trimetilsilil)-imidazol 0.002 N-benzoilimidazol 0.078 + 1-(2-oxo-2-fenil-etil)-imidazol 0.002 1-(3-aminopropil)-imidazol 0.107 + 1 -fenilrmidazol 0.003 1,1'-sulfon¡limidazol 0.167 + 0.007 0.174 + 0.007 0.184 + 0.005 0.41 + 0.01 sin inhibición sin inhibición Derivados de C-4(5) N-omega~acet¡lhistamina 0.017 + L-h¡stidinamid'a 0.001 H-H¡s-Trp-OH 0.56 + L- istidinol 0.04 L-histidina 0.60 + 4-imidazol-carboxaldehído 0.03 Metiléster de Ácido imidazol-4- 1.53 + carbónico 0.12 L-histamina 4.4 + 0.2 7.6 + 0.7 14.5 + 0.6 0.85 + 0.04 Derivados de C-4,5 5-hidroximetil-4-metil-imidazol 0.129 + Amida de ácido 4-am¡no-imidazol-5- 0.005 carbónico 0.129 + 4,5-difenil-imidazol 0.005 4,5-dicianoimidazol Sin inhibición Tabla 4: Inhibición de QC por L-histamina y sus dos metabolitos biológicos (también conocidos como tele- metilhistamina). f Compuesto Valor K¡ (mM) Estructura L-histamina 0.85 + 0.04 3-metil-4-(/?- 0.120 + 0.004 aminoetil)-imidazol 1 -metil-4-O0- n.i. aminoet¡l)-imidazoI En una quinceaba modalidad, nuevos inhibidores de enzimas QC y tipo QC, basados en cisteamina, se proporcionan. Además de los derivados de imidazol e hidroxamatos, los reactivos de tilo frecuentemente se describen como inhibidores de enzimas dependientes de metal (Lowther, W. T. Y Matthews, B. W. 2002 Chem Rev 102, 4581 -4607; Lipscomb, W. N. y Stráter, N. 1 996 Chem Rev 96, 2375-2433). Adicionalmente, los péptidos de tilo se describieron como inhibidores de aminopeptidasa relacionada a QC del Clan MH (Huntington, K.M et al. 1999 Bioc emistry 38, 15587-15596). A pesar de que estos inhibidores son inactivos con respecto a las QCs de mamífero, fue posible aislar los derivados de cisteamina como inhibidores de QC competitivos potentes (Figura 23). La presente invención proporciona inhibidores QC que pueden describirse generalmente por la fórmula 1 o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, incluyendo todos los estereoisómeros: en donde R1 - R6 son independientemente H o una cadena de alquilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquenilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquinilo ramificado o no ramificado, carbocíclico, arilo, heteroarilo, heterocíclico, ácido aza-amino, aminoácido o un mimético de los mismos; todos los residuos antrioeres opcionalmente sustituyéndose y n es 0, 1 o 2, preferentemente 1 , más preferentemente 0. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la expresión "alquilo" puede señalar un grupo alquilo C1 -50, preferentemente un grupo Ci.3o, especialmente un grupo alquilo Ci-12 o C1 -8; por ejemplo, un grupo alquilo puede ser un grupo metilo, etilo, propilo, isopropilo o butilo. La expresión "alq", por ejemplo en la expresión "alcoxi", y la expresión "alean", por ejemplo en la expresión "alcanoil", se definen como para "alquilo"; los compuestos aromáticos ("arilo") son grupos fenilo, bencilo, naftilo, bifenilo o antraceno preferentemente sustituidos u opcionalmente no sustituidos, los cuales preferentemente tienen al menos 8 átomos C; la expresión "alquenilo" puede señalar un grupo alquenilo C2.i o, preferentemente un grupo alquenilo C2-6 , el cual tiene el (Jos) enlace (s) doble (s) en cualquier ubicación deseada y pueden sustituirse o no sustituirse; la expresión "alquinilo" puede señalar un grupo alquinilo C2-10, preferentemente un grupo alquinilo C2-6 , el cual tiene el (los) enlace (s) triple (s) en cualquier ubicación deseada y pueden sustituirse o no sustituirse; la expresión "sustituirse" o sustituyente puede señalar cualquier sustitución deseada por uno o más, preferentemente uno o dos, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, mono- o multi-valente acilo, alcanoilo, acoxialcanoilo o alcoxialquilo; los sustituyentes anteriormente mencionados pueden a su vez tener uno o más grupos (pero preferentemente cero) alquilo, alquenilo, alquinilo, mono- o multi-valente acilo, alcanoilo, alcoxialcanoilo o alcoxialquilo como grupos laterales. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la expresión "acilo" puede señalar un residuo acilo C1 -20, preferentemente un residuo de acilo C1 -8 y especialmente preferido un residuo C-i -4 ; y "carbocíclico" puede señalar un residuo carbocíclico C3-1 2 , preferentemente un residuo carbocíclico C4, C5, y C6. "heteroarilo" se define como un residuo de arilo, en donde 1 a 4, y más preferentemente 1 , 2, o 3 átomos de anillo se reemplazan por heteroátomos tipo N, S o O. "Heterocíclico" se define como un residuo cicloalquilo, en donde 1 , 2, o 3 átomos de anillo se reemplazan por heteroátomos tipo N, S o O. "Miméticos de péptido" por sí mismos se conocen por un experto en la materia. Se definen preferentemente como compuestos que tienen una estructura secundaria tipo un péptido yocpionalmente además características estructurales; su modo de acción es mayormente similar o idéntico al modo de acción del péptido nativo; sin embargo, su actividad (por ejemplo, un antagonista o inhibidor) puede modificarse según se compara con el péptido nativo, especialmente receptores o enzimas vis á vis. Además, pueden imitar el efecto del péptido nativo (combatiente). Los ejemplos de miméticos de péptido son miméticos de andamio, miméticos no peptídicos, peptoides, ácidos nucleicos de péptido, oligopirrolinonas, vinilogpéptidos y oligocarbamatos. Para las definiciones de estos miméticos de péptido véase Lexikon der CEI E, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlín, 1999. Un "ácido aza-amino" se define como un aminoácido en donde el grupo a-CH quiral se reemplaza por un átomo de nitrógeno, mientras que un "aza-péptido" se define como un péptido, en el cual el grupo a-CH quiral de uno o más residuos de aminoácidos en la cadena de péptido se reemplaza por un átomo de nitrógeno. El papel del grupo amino y tilo se subraya por una comparación de la potencia inhibidora de dimetilcisteamina, cisteamina, mercaptoetanol, etilendiamina, etanolamina, según se muestra en la tabla 5. Solamente los compuestos que llevan el grupo tiol y amino fueron potentes, la pérdida o modificación de cualquier grupo condujo a una reducción en poder inhibidor. Además, la pH-dependencia de . inhibición de QC murino por cisteamina,. dimetil-cisteamina y mercaptoetanol reveló diferencias, indicando que el estado de protonización del inhibidor influye en la unión del inhibidor al sitio activo (Figura 22).

Tabla 5. Comparación de la potencia de compuestos derivados de cisteamina para inhibir QC (n.¡. , no inhibición detectada en una concentración de 5 mM, pH=8.0, 30°C y una concentración de ssutrato de 1 KM en la muestra, n.d. , no determinada).

Compuesto ?,-vaior (mM) Estructura Cisteamina 0.043 + 0.002 Dimetil-cisteamina 0.0190 + 0.0002 I Dietil-cisteamina 0.0109 + 0.0004 HS ' Mercaptoetanol 3.91 + 0.08 HS. OH Etilmercaptano n.d.

Etilendiamina n. ¡.

Etanolamina n.i.

Sorprendentemente, durante la caracterización de la actividad enzimática se descubrió que además de un residuo glutaminil de N-terminal, los residuos de ß-homo-glutaminil de N-terminal también satisfacen las propiedades como sustratos de QCs de las plantas y mamíferos. El residuo de ß-homo-glutaminil de N-terminal se convirtió en anillo lactam de cinco miembros por catálisis de QC de papaya y humana, respectivamente. Los resultados se describen en el ejemplo 5. El método aplicado se ilustra en el ejemplo 2 y la síntesis de péptido se realizó según se describe en el ejemplo 6. Otra modalidad preferida de la presente invención comprende los métodos de selección para los efectores de QC. Un método de selección preferido para identificar los efectores modificadores de actividad de QC de un grupo de compuestos comprende las etapas de: a) contactar dichos compuestos con QC bajo condiciones que podrían permitir la unión entre los mismos; b) agregar un sustrato de QC; c) monitoréar ¦ la conversión del sustrato u opcionalmente medir la actividad de QC residual; y d) calcular cambios en la conversión de sustrato y/o actividad de enzima de QC para identificar un efector modificador de actividad. Otro método de selección preferido se refiere a un método para la identificación y selección de efectores que interactúan directa o indirectamente con el ión metálico unido por sitio activo de QC y comprende las siguientes etapas: a) contactar dichos compuestos con QC bajo condiciones que podrían permitir la unión entre los mismos; b) agregar un sustrato de QC que es sujeto a conversión por QC; c) monitorear la conversión del sustrato u opcionalmente medir la actividad de QC residual; y d) calcular cambios en la conversión de sustrato y/o actividad de enzima de QC en donde los cambios pueden utilizarse para identificar un efector modificador de actividad de QC. Se prefieren para el uso en los métodos de selección anteriormente descritos la QC de mamífero o QC de papaya. Especialmente se prefiere QC de mamífero, ya que los efectores identificados por estos métodos de selección deberán utilizarse para el tratamiento de enfermedades en mamíferos, especialmente en humanos. Los agentes seleccionados por los métodos de selección anteriormente descritos pueden trabajar al reducir la conversión de al menos un sustrato de QC (efectores negativos, inhibidores), o al aumentar la conversión de al menos un sustrato de QC (efectores positivos, accionadores).

Los compuestos de la presente invención pueden convertirse en sales de adición ácida, especialmente sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables. Las sales de [os compuestos de la invención pueden encontrarse en la forma de sales orgánicas e inorgánicas. Los compuestos de la presente invención pueden convertirse en y utilizarse como sales de adición ácida, especialmente sales de adición ácida farmacéuticamente aceptables. La sal farmacéuticamente aceptable generalmente toma la forma en la cual una cadena lateral básica se protoniza con un ácido orgánico o inorgánico. Los ácidos inorgánicos u orgánicos representativos incluyen ácido hidroclórico, hidrobrómico, perclórico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, acético, propiónico, glicólico, láctico, succínico, maleico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, benzoico, mandélico, metanosulfónico, hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, oxálico, pamoico, 2-naftalenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclohexanosulfámico, salicílico, sacarínico o trifluoroacético. Todas las formas de sal de adición ácida farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención se pretenden que se incluyan por el alcance de esta invención. En vista de la relación cercana entre los compuestos libres y los compuestos en la forma de sus sales, cuando se refiere a un compuesto en este contexto, una sal correspondiente también se pretende, con la condición de que tal sea posible o adecuada bajo las circunstancias.

En donde los compuestos de acuerdo a esta invención tienen al menos un centro quiral, pueden de acuerdo con lo anterior existir como enantiómeros. En donde los compuestos poseen dos o más centros quirales, pueden adicionalmente existir como diastereómeros. Se entenderá que todos de tales isómeros y mezclas de los mismos se comprenden dentro del alcance de la presente invención . Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos pueden existir como polimorfos y como tales se pretende que se incluyan en la presente invención. Además, algunos de los compuestos pueden formar solvatos con agua (es decir, hidratos) o solventes orgánicos comunes, y tales solvatos también se pretende que se comprendan dentro del alcance de esta invención. Los compuestos, incluyendo sus sales, también pueden obtenerse en la forma de sus hidratos, o incluyen otros solventes utilizados para su cristalización. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona un método para prevenir o tratar una condición mediada por modulación de la actividad de enzima QC en un sujeto en necesidad de la misma el cual comprende administrar cualquiera de los compuestos de la presente invención o composiciones farmacéuticas de los mismos en una cantidad y régimen de dosificación terapéuticamente eficaz para tratar la condición. Adicionalmente, la presente invención incluye el uso de los compuestos de esta invención, y sus formas de sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable correspondiente, para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una condición mediada por modulación de la actividad de QC en un sujeto. El compuesto puede administrarse a un paciente por cualquier vía de administración convencional, incluyendo, pero no limitándose a, intravenosa, oral, subcutánea, intramuscular, intradérmica, parenteral y combinaciones de las mismas. En una forma preferida adicional de implementación, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas, es decir, medicamentos, que contienen al menos un compuesto de la invención o sales del mismo, opcionalmente en combinación con uno o más vehículos y/o solventes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas pueden, por ejemplo, encontrarse en la forma de formulaciones entéricas o parenterales y contienen vehículos adecuados, o pueden encontrarse en la forma de formulaciones orales que pueden contener vehículos adecuados propios para la administración oral. Preferentemente, se encuentran en la forma de formulaciones orales. Los efectores de actividad de QC administrados de acuerdo a la invención pueden emplearse en formulaciones farmacéuticamente administrables o complejos de formulación como inhibidores o en combinación con inhibidores, sustratos, pseudosustratos, inhibidores de expresión de QC, proteínas de unión o anticuerpos de aquellas proteínas de enzima que reducen la concentración de proteína de QC en mamíferos. Los compuestos de la invención hacen posible ajustar el tratamiento individualmente a pacientes y enfermedades, siendo posible, en particular, evitar intolerancias individuales, alergias y efectos secundarios. Los compuestos también muestran grados diferentes de actividad como una función de tiempo. Se le brinda de tal modo al doctor que proporciona el tratam iento la oportunidad para responder de manera diferente a la situación individual de pacientes: él es capaz de ajustar precisamente, por un lado, la velocidad del inicio de acción y, por el otro lado, la duración de acción y especialmente la intensidad de acción . Un método de tratamiento preferido de acuerdo a la invención representa un n uevo procedim iento para la prevención o tratamiento de una condición mediada por modulación de la actividad de enzima de QC en mamíferos . Es ventajosamente sim ple, susceptible de aplicación comercial y adecuado para uso, especialmente en el tratam iento de enfermedades que se basan en la concentración no balanceada de sustratos de QC fisiológicos activos, por ejemplo, listados en las Tablas 1 y 2, en mam íferos y especialmente en medicina humana. Los compuestos pueden administrarse ventajosamente, por ejem plo, en la forma de preparaciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo en combinación con aditivos normales como diluyentes, excipientes y/o vehículos conocidos de la técnica anterior. Por ejemplo, pueden administrarse parenteralmente (por ejemplo , i. v. en solución salina fisiológica) o entéricamente (por ejemplo, oralmente, form ulada con veh ículos normales) .

Dependiendo de su estabilidad endógena y su biodisponibilidad, una o más dosis de los compuestos pueden darse por día a fin de lograr la normalización deseada de los valores de glucosa sanguínea. Por ejemplo, tal rango de dosificación en humanos puede encontrarse en el rango de desde aproximadamente 0.01 mg a 250.0 mg por día, preferentemente en el rango de desde aproximadamente 0.01 a 100 mg de compuesto por kilogramos por peso corporal. Al administrar los efectores de la actividad de QC a un mamífero podría ser posible prevenir o aminorar o tratar las condiciones seleccionadas de la enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Down, enfermedad de úlcera y cáncer gástrico con o c/o infecciones Heliobacter pylori, condiciones psicóticas patogénicas, esquizofrenia, infertilidad, neoplasia, respuestas huésped inflamatorias, cáncer, psoriasis, artritis reumatoide, aterosclerosis, respuestas inmune mediadas por célula y humorales deterioradas, procesos de migración y adhesión de leucocitos en el endotelio, toma alimenticia deteriorada, insomnio, regulación homeostática deteriorada de metabolismo de energía, función autonómica deteriorada, regulación deteriorada y balance hormonal deteriorado de fluidos corporales. Además, al administrar los efectores de actividad de QC a un mamífero podría ser posible estimular la proliferación de célula de tracto gastrointestinal, preferentemente la proliferación de células mucosales gástricas, células epiteliales, secreción de ácido aguda y la diferenciación de células parietales productoras de ácido y células tipo enterocromafina secretoras de histamina. Además, la administración de los inhibidores de QC a mamíferos puede conducir a una pérdida de función de célula esperma suprimiendo de esta manera la fertilidad masculina. De esta manera, la presente invención proporciona un método para la regulación y control de fertilidad masculina y el uso de efectores de disminución de actividad de QC para la preparación de medicamentos anticonceptivos para hombres. Además, al administrar los efectores de actividad de QC a un mam ífero puede ser posible suprimir la proliferación de células progenitoras de mieloide. Los compuestos utilizados de acuerdo a la invención pueden convertirse de acuerdo con lo anterior en una manera conocida per se en formulaciones convencionales, tales como, por ejemplo, tabletas, cápsulas, grageas, pildoras, supositorios, gránulos, aerosoles, jarabes, líquido, sólido y em ulsiones tipo crema y suspensiones y soluciones, utilizando vehículos y aditivos o solventes farmacéuticamente adecuados, inertes, no tóxicos. En cada una de estas form ulaciones, los compuestos terapéuticamente eficaces se presentan preferentemente en una concentración de aproximadamente de 0.1 a 80% en peso, más preferentemente de 1 a 50% en peso, de la mezcla total, es decir, en cantidades suficientes para la latitud de dosificación mencionada a obtener. Las sustancias pueden utilizarse como medicamentos en la forma de grageas, cápsulas, cápsulas masticable, tabletas, gotas, jarabes o también como supositorios o como rociadores nasales. Las formulaciones pueden prepararse ventajosamente, por ejemplo, al extender el ingrediente activo con solventes y/o vehículos, opcionalmente con el uso de emulsificadores y/o dispersantes, siendo posible, por ejemplo, en el caso en donde se utiliza agua como diluyente, para solventes orgánicos utilizarse opcionalmente como solventes auxiliares. Los ejemplos de excipientes útiles en relación con la presente invención incluyen: agua, solventes orgánicos no tóxicos, tales como parafinas (por ejemplo, fracciones de aceite natural), aceites vegetales (por ejemplo, aceite de semilla de colza, aceite de nuez triturada, aceite de ajonjolí) alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, glicerol), glicoles (por ejemplo, propilénglicol, polietilenglicol); vehículos sólidos, tales como, por ejemplo, minerales en polvo natural (por ejemplo, sílice altamente disperso, silicatos), azúcares (por ejemplo, azúcar fina, lactosa y dextrosa); emulsificadores, tales como emulsificadores amónicos y no iónicos (por ejemplo, ésteres de ácido graso de polioxietileno, éteres de alcohol graso de polioxietileno, alquilsulfonatos y arilsulfonatos), dispersantes (por ejemplo, lignina, licores de sulfita, metilcelulosa, almidón y polivinilpirrolidona) y lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, ácido estéarico y sulfato de laurilo de sodiof) y opcionalmente saborizantes. La administración puede llevarse a cabo en la manera usual, preferentemente de manera entérica o parenteral, especialmente de manera oral. En el caso de la administración entérica, las tabletas pueden contener además los vehículos mencionados más aditivos tales como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio, junto con varios aditivos, tales como almidón, preferentemente almidón de papa, gelatina y lo similar. Además, los lubricantes, tales como estearato de magnesio, sulfato de laurilo de sodio y talco, pueden utilizarse concomitantemente para la formación de tabletas. En el caso de suspensiones acuosas y/o elíxires pretendidos para la administración oral, varios colorantes o correctivos de sabor pueden agregarse a los ingredientes activos además de los excipientes anteriormente mencionados. En el caso de administración parenteral, las soluciones de los ingredientes activos que utilizan vehículos líquidos adecuados pueden emplearse. En general, se ha encontrado ventajoso administrar, en el caso de administración intravenosa, cantidades de aproximadamente de 0.01 a 2.0 mg/kg, preferentemente aproximadamente de 0.01 a 1 .0 mg/kg, de peso corporal por día para obtener resultados eficaces y, en el caso de administración entérica, la dosificación es aproximadamente de 0.01 a 2 mg/kg, preferentemente aproximadamente de 0.01 a 1 mg/kg, de peso corporal por día. Sin embargo, puede ser necesario en algunos casos desviarse de las cantidades establecidas, dependiendo del peso corporal del animal o el paciente experimental o del tipo de vía de administración, pero también sobre la base de las especies de animal y su respuesta individual al medicamento o el intervalo en el cual la administración se lleva a cabo . De acuerdo con lo anterior, puede ser suficiente en algunos casos utilizar menos de la cantidad m ínima anteriormente mencionada, mientras que en otros casos, el límite superior mencionado tendrá que exacerbarse. En casos en donde cantidades relativamente grandes se están administrando, puede ser aconsejable dividir aq uellas cantidades en varias dosis únicas durante el día. Para la administración en medicina humana, la misma latitud de dosificación se proporciona. Las remarcas anteriores aplican análogamente en ése caso.

Ejemplos de formulaciones farmacéuticas 1 . Cápsulas que contienen 1 00 mg de un compuesto de la invención por cápsula: Para aproximadamente 10, 000 cápsulas una solución de la siguiente composición se prepara: Compuesto de la invención 1 .0 kg Glicerol 0.5 kg Polietilenglicol 3.0 kg Agua 0.5 kg 5.0 kg La solución se introduce en cápsulas de gelatina suave en una manera conocida per se. Las cápsulas son adecuadas para masticarse o tragarse. 2. Tabletas o tabletas o grageas revestidas que contienen 1 00 mg de un compuesto de la invención: Las siguientes cantidades se refieren a la preparación de 1 00, 000 tabletas : compuesto de la invención , finamente triturado 1 0.0 kg glucosa 4.35 kg lactosa 4.50 kg almidón 4.50 kg celulosa, finamente triturada 4.50 kg Los constituyentes anteriores se mezclan y se proporcionan así con una solución preparada de polivinilpirrolidona 2.0 kg polisorbato 0.1 kg y agua aprox. 5.0 kg y se granulan en una manera conocida per se al frotar la masa húmeda y, después de la adición de 0.2 kg de estearato de magnesio, secándolo. La mezcla de tableta acabada de 30.0 kg se procesa para formar tabletas convexas que pesan 300 mg. De manera ideal , las tabletas pueden revestirse o revestirse por azúcar en una manera conocida per se. Las composiciones farmacéuticas definidas a lo largo de la especificación ventajosamente contienen una combinación de al menos un efector de la actividad de QC y al menos un inhibidor DP IV.

Tales composiciones farmacéuticas son especialmente útiles para el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer y Síndrome de Down .

Ejemplo 1: Preparación de QC Humana y de Papaya Cepas y medios huésped La cepa Pichia pastoris X33 {A OX1, AOX2), utilizadas para . la expresión de QC humana creció, se transformó y se analizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los medios requeridos para P. pastoris, es decir, medio com plejo de glicerol regulado (BMGY) o complejo de metanol (BMMY) , y el medio de sales básicas de fermentación se prepararon de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

Clonación Molecular de vectores de plásm ido de acuerdo a la QC humana Todos los procedimientos de clonación se hicieron aplicando las técnicas de biología molecular estándar. Para la expresión en levadura, el vector pPICZaB (Invitrogen) se utilizó. El vector pQE-3 (Qiagen) se utilizó para expresar la QC humana en E. coli. El cADN de la QC madura comenzando con el codon 38 se fusionó en estructura con la etiqueta 6xhistidina codificada por plásmido. Después de la amplificación utilizando los cebadores pQCy- 1 y pQCy-2 y subclonación, el fragmento se insertó en el vector de expresión empleando los sitios de restricción de Sph\ y Hind\ \\ .

Transformación de P. pastoris y expresión de m ini-escala El ADN plásmido se am plificó en E. coli JM109 y se purificó de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Qiagen). En el plásmido de expresión utilizado, pPI CZaB , tres sitios de restricción se proporcionan para la linealización. Ya que Sacl y BstXl se cortan dentro del cADN de QC, se seleccionó Pme\ para la linealización . 20-30 de ADN de plásmido se linealizó con Pmel , se precipitó por etanol , y se disolvió en agua desmineralizada, estéril. 1 0 //g del ADN se aplicó así para la transformación de células P. pastoris competentes por electroporación de acuerdo a las instrucciones del fabricante (BioRad). La selección se hizo en placas que contienen 1 50 ¿g/ml de Zeccin . Una transformación utilizando el plásmido linealizado produjo varios cientos de transformantes. A fin de probar los clones de levadura recom binante para la expresión de QC, los recombinantes crecieron por 24 h en 1 0 m L de tubos cónicos que contienen 2 mi de BMGY. Después de allí, la levadura se centrifugó y se volvió a suspender en 2 mi de BMMY conteniendo 0.5% de metano. Esta concentración se mantuvo por adición de metanol cada 24 h hasta 72 h. Por consecuencia, la actividad de QC en el sobrenadante se determinó. La presencia de la proteína de fusión se confirmó por análisis western blot utilizando un anticuerpo dirig ido contra la etiqueta 6xhistidina (Qiagen). Los clones que mostraron la actividad de QC más alta se seleccionaron para experimentos adicionales y fermentación.

Expresión a gran escala en un fermentador La expresión de la QC se realizó en un reactor de 5 I (Biostat B, B. Braun biotech) , esencialmente según se describe en las "instrucciones del proceso de fermentación de Pichia" (I nvitrogen). En resumen , las células crecieron en el medio de sales básicas de fermentación complementado con sales indicio, y con glicerol como la única fuente de carbono (pH 5.5) . Durante una fase de grupo inicial por aproximadamente 24 h y una fase de grupo de alimentación subsecuente por aproximadamente 5 h , la masa celular se acumuló. Una vez q ue se logró un peso húmedo de célula de 200 g/l, la inducción de la expresión de QC se realizó utilizando metanol aplicando una config uración de alimentación de tres etapas para un tiempo completo de fermentación de aproximadamente 60 h . Por consecuencia, las células se removieron del sobrenadante que contiene QC por centrifugación a 6000xg , 4°C por 1 5 min. El pH se ajustó a 6.8 por adición de NaOH, y la solución turbia resultante se centrifugó nuevamente a 37000xfir, 4° C por 40 min. En casos de turbidez continua, una etapa de filtración adicional se aplicó utilizando una mem brana de celulosa (ancho de poro 0.45 /m).

Purificación de QC con etiq ueta 6xhistídina expresada en P. pastoris La QC con etiqueta His se purificó primero por cromatografía de afinidad metálica inmovilizada (I AC). En una purificación típica, 1 000 mi de sobrenadante de cultivo se aplicaron a una colum na de Sefarosa Quelante FF cargada con Ni2+ ( 1 .6 x 20 cm, Pharmacia) , que se eq uilibró con 50 mM de regulador de fosfato, pH 6.8, conteniendo 750 m M de NaCI, a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Después de lavarse con 1 0 volúmenes de columna de regulador de equilibrio y 5 volúmenes de columna de regulador de equilibrio conten iendo 5 mM de histidina, la proteína unida se eluyó por un cambio a 50 mm de regulador de fosfato, pH 6.8, conteniendo 1 50 mM de NaCI y 100 mm de histidina. El eluato resultante se dializó contra 20 mM de Bis-Tris/HCl, pH 6.8, a 4°C durante la noche. Por consecuencia , la QC se purificó además por cromatografía de intercambio de anión en una columna Mono Q6 (BioRad) , equilibrada con regulador de diálisis. La fracción que contiene QC se cargó sobre la columna utilizando una velocidad de flujo de 4 ml/min. La columna se lavó así con regulador de equilibrio conteniendo 1 00 mM de NaCI . La elución se realizó por dos gradientes dando como resultado el regulador de equilibrio conteniendo 240 mM y 360 mM de NaCI en 30 o 5 volúmenes de columna, respectivamente. Las fracciones de 6 mi se colectaron y la pureza se analizó por SDS-PAGE. Las fracciones q ue contienen QC homogénea se agruparon y se concentraron por ultrafiltración. Para el almacenamiento a largo plazo (-20°C) , se agregó glicerol a una concentración final de 50% . La proteína se cuantificó de acuerdo a los métodos de Bradford o Gilí y von Hippel (Bradford, M.M. 1 976 Anal Biochem 72, 284-254; Gilí, S. C. y Von Hippel , P. H . 1989 Anal Biochem 182, 31 9-326).

Expresión y purificación de QC en E. coli La construcción que codifica la QC se transformó en células M 1 5 (Qiagen) y creció en placas ágar LB selectivas a 37°C. La expresión de proteina se llevó a cabo en el medio LB conteniendo 1 % de glucosa y 1 % de etanol a temperatura ambiente. Cuando el cultivo alcanzó una OD60o de aproximadamente 0.8, la expresión se indujo con 0.1 m M de I PTG durante la noche. Después de un ciclo de congelación y descongelación , las células se destruyeron por Usinas a 4°C por adición de 2.5 mg/ml de lisozima en 50 mM de regulador de fosfato, pH 8.0, conteniendo 300 mM de Nací y 2 mM de histidina por aproximadamente 30 min. La solución se clarificó por centrifugación a 37000x0/, 4°C por 30 min, seguida por una filtración aplicando un vidrio poroso (separación de ADN) y dos etapas de filtración adicionales aplicando filtros de celulosa para precipitados crudos y finos. El sobrenadante (aprox. 500 m i) se aplicó sobre una columna de afinidad de Ni2+ (1.6 x 20 cm) a una velocidad de flujo de 1 ml/min. La elución de QC se llevó a cabo con 50 m M de regulador de fosfato que contiene 150 M de NaCI y 1 00 mH de histidina. La fracción que contiene QC se concentró por ultrafiltración.

Purificación de QC de látex de papaya QC del látex de papaya se preparó utilizando el BioCAD 700E (Perseptive Biosystems, Wiesbaden , Alemania) con una versión modificada de un método previamente reportado (Zerthouni, S. et al. , 1 989 Biochim Biophys Acta 138, 275-290) . 50 g de látex se disolvió en agua y se centrifugó según se describe en la presente. La inactivación de proteasas se realizó con metanotiosulfonato S-metilo, y el extracto crudo resultante se dializó. Después de la diálisis, el sobrenadante completo se cargó sobre una columna de Rápido Flujo de Sefarosa SP (21 X 2.5 cm de i.d.) , se equilibró con 100 mM de regulador de acetato de sodio, pH 5.0 (velocidad de flujo 3 ml/min). La elución se realizó en tres etapas al aumentar la concentración de regulador de acetato de sodio a una velocidad de flujo de 2 ml/min. La primera etapa fue un gradiente lineal de 0.1 a 0.5 M de regulador de acetato en 0.5 volúmenes de columna. La segunda etapa fue un aumento lineal en la concentración reguladora de 0.5 a 0.68 en cuatro volúmenes de columna. Durante la última etapa de elución, un volumen de columna de 0.85 M de regulador se aplicó. Las fracciones (6 mi) que contienen la actividad enzimática más alta se agruparon. La concentración y los cambios de regulador a 0.02 M de Tris/HCI, pH 8.0 se realizaron por medio de ultrafiltración (Amicon; corte de masa molecular de la membrana 1 0 kDa). El sulfato de amonio se cargó a la enzima de papaya concentrada, obtenida de la etapa de cromatografía de intercambio de ión a una concentración final de 2 M. Esta solución se aplicó sobre una columna de Rápido Flujo de Sefarosa Butil 4 (21 X 2.5 cm i.d.) (velocidad e flujo 1 .3 ml/min), se equilibró con 2M de sulfato de amonio, 0.02 de Tris/HCI, pH 8.0. La elución se realizó en tres etapas con concentraciones reductoras de sulfato de amonio. Durante la primera etapa un gradiente lineal de 2 a 0.6M de sulfato de amonio, 0.02M de Tris/HCI, pH 8.0 se aplicó por 0.5 volúmenes de columna a una velocidad de flujo de 1 .3 ml/min. La segunda etapa fue un gradiente lineal de 0.6 a OM de sulfato de amonoi, 0.02 M de Tris/HCI, pH 8.0, en 5 volúmenes de columna a una velocidad de flujo de 1 .5 ml/min. La última etapa de elución se llevó a cabo al aplicar 0.02 M de Tris/HCI a pH 8.0 por 2 volúmenes de col umna a una velocidad de flujo de 1 .5 ml/min . Todas las fracciones que contienen actividad de QC se agruparon y se concentraron por ultrafiltración. La QC homogénea resultante se almacenó a -70°C. Las concentraciones de proteína finales se determinaron utilizando el método de Bradford, en comparación a una curva estándar obtenida con albúmina de suero de bovino.

Ejemplo 2: Ensayos para actividad de ciclasa de glutamina Ensayos Fluorométricos Todas las mediciones se realizaron con un Lector de BioEnsayo HTS-7000Plus para microplacas (Perkin Elmer) a 30°C. La actividad de QC se evaluó de manera fluorométrica utilizando H-GIn-/?NA. Las muestras consistieron de 0.2 mM de sustrato fluorogénico, 0.25 U de aminopeptidasa de piroglutamilo (Unizyme, Horsholm, Dinamarca) , en 0.2 M de Tris/HCI, pH 8.0 conteniendo 20 mM de EDTA y una alícuota adecuadamente diluida de QC en un volumen final de 250 µ\ . Las longitudes de onda de excitación/emisión fueron 320/41 0 nm . Las reacciones de ensayo se iniciaron por adición de ciclasa de glutaminil. La actividad de QC se determinó de una curva estándar de /?-naftilamina bajo condiciones de ensayo. Una unidad se define como la cantidad de QC que cataliza la formación de 1 ¿¿mol de pGlu-/?IMA de H-Gln-/7NA por m inuto bajo las condiciones descritas. En un segundo ensayo flurométrico, la QC fue la actividad que se determinó utilizando H-GIn-AMC como sustrato. Las reacciones se llevaron a cabo a 30°C utilizando el lector NOVOStar para microplacas, (BMG labtechnologies) . Las m uestras consistieron de concentraciones variantes del sustrato fluorogénico , 0. 1 U de am inopeptidasa de piroglutamilo (Qiagen) en 0.05 M de Tris/HCI, pH 8.0 conteniendo 5 mM de EDTA y una alícuota adecuadamente diluida de QC en un volumen final de 250 µ\. Las longitudes de onda de excitación/emisión fueron 380/460 nm. Los ensayos de reacción se iniciaron por adición de ciclasa de glutaminil. La actividad de QC se determinó de una curva estándar de 7-amino-4-metilcumarina bajo condiciones de ensayo. Los datos cinéticos se evaluaron utilizando el software GraFit.

Ensayo espectrofotométrico de QC Este nuevo ensayo se utilizó para determinar , los parámetros cinéticos para la mayoría de los sustratos QC . La actividad de QC se analizó espectrofotométricamente utilizando un método continuo, que se derivó al adaptar un ensayo discontinuo previo (Bateman , R. C. J . 1 989 J. Neurosci Methods 30, 23-28) utilizando la déhid rogenasa de glutamjato como enzima auxiliar. Las muestras consitieron del sustrato QC respectivo, 0.3 mM de NADH , 14 m de ácido a-cetoglutárico y 30 U/mi de dehidrogenasa de glutamato en un volumen final de 250 µ\. Las reacciones se iniciaron por adición de QC y se persiguieron por monitoreo de la reducción en absorción a 340 nm por 8-1 5 min. Los cursos de tiempo típicos de formación de producto se presentan en la Figura 1. Las velocidades iniciales se evaluaron y la actividad enzimnática se determinó de una curva estándar de amonio bajo condiciones de ensayo. Todas las muestras se midieron a 30°C, utilizando ya sea SPECTRAFluorPlus o el lector SUNRISE (ambos de TECAN) para microplacas. La información cinética se evaluó utiolizando el software GraFit.

Ensayo Inhibidor Para la prueba de inhibidor, la composición de muestra fue la misma según se describió anteriormente, excepto del compuesto inhibidor putativo agregado. Para una rápida prueba de inhibición de QC, las muestras contuvieron 4mM del inhibidor respectivo y una concentración de sustrato a 1 M- Para investigaciones detalladas de la inhibición y determinación de valores K¡, la influencia del inhibidor en las enzimas auxiliares se investigó primero. En cada caso, no hubo influencia en ninguna enzima detectada, permitiendo de esta manera la determinación confiable de la inhibición de QC. La constante de inhibición se evaluó al ajusfar el grupo de curvas de avance a la ecuación general para la inhibición competitiva utilizando el software GraFit.

Ejemplo 3: espectrometría de masa MALDI-TOF La espectrometría de masa de deserción/ionización láser auxiliada por aglomerante se llevó a cabo utilizando el Sistema Hewlett-Packard G2025 LD-TOF con u n tiempo lineal de analizador de vuelo. El instrumento se equipo con un láser de nitrógeno de 337 nm , una fuente de aceleración potencial (5 kV) y un tubo de vuelo de 1 .0 m . La operación de detector fue en el modo de ión positivo y las señales se registraron y se filtraron utilizando el osciloscopio de almacenam iento dig ital LeCroy 9350 M ligado a una computadora personal. Las muestras (5 µ\) se mezclaron con volúmenes iguales de la solución aglomerante. Para la solución aglomerante utilizamos DHAP/DAHC, prepardos al diluir 30 mg 2', 6'-dihidroxiacetofenona (Aldrich) y 44 mg de citrato de hidrógeno de diamonio (Fluka) en 1 m L de acetonitrilo/0.1 % de TFA en agua ( 1 /1 , v/v). Un pequeño volumen (1 = ¿l) de la mezcla de aglomerante-analito se transfirió a una punta de medidor y se evaporó inmediatamente en una cámara al vacío (Hewelett-Packard G2024 m uestra prep. Accesorio) para aseg urar la rápida y homogénea cristalización de muestra. Para la prueba a largo plazo de Glu1-ciclización, los péptidos derviados de ?ß se incubaron en 1 00 µ\ de 0.1 M de reg ulador de acetato de sodio, pH 5.2 o 0.1 M de regulador Bis-Tris, pH 6.5 a 30°C. Los péptidos se aplicaron en concentraciones 0.5 mM [Ap3-1 1 a] o 0. 1 5 mM [?ß3-21 ß] , y 0.2 U QC se agregó todas las 24 horas. En caso de ?ß(3-1 1 ) 8, los ensayos contuvieron 1 % de DMSO.

En diferentes tiempos, las muestras se removieron del tubo de ensayo, Iso péptidos se extrajeron utiolizando ZipTips (Millipore) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, mezclas con solución aglomerante 1 : 1 (v/v) y por consecuencia los espectros de masa se registraron. Los controles negativos ya sea no contenían QC ni enzima desactivada por calor. Para los estudios de inhibidor, la composición de muestra fue la misma que la anteriormente descrita, con excepción del compuesto inhibidor ag regado (5 mM de bencim idazol o 2 mM de 1 , 1 0-fenantrolina) .

Ejemplo 4: dependencia de pH La dependencia de pH de catálisis de QC humana y de papaya se investigó bajo las condiciones de tasa de primer orden , reflejando de esat manera el impacto de concentración de protones en la constante de especificidad kcat/KM. Para estos propósitos, el ensayo enzimático acoplado utilizando aminopeptidasa de piroglutamil como enzima auxiliar y Gln- ?NA como sutrato se utilizó. La am inopeptidasa de piroglutamil se mostró que era activa y estable entre el pH 5.5-8.5 (Tsuru , D. et al. , 1 978 J Biochem (Tokio) 84, 467-476). De all í, el ensayo permitió el estudio de catálisis de QC en esta región pH . Los perfiles de tasa obtenidos se ajustaron a las curvas en forma de campana clásica, según se muestra en la Figura 2. La QC humana lleva una pH-dependencia muy estrecha con una óptima a aproximadamente pH 7.8-8.0. La tasa tendió a reducirse a pH más básico. Esto en contraste al perfil de tasa observado con QC de papaya, que no mostró caída en actividad hasta pH 8.5 (Figura 2, inicio) . Sin embargo, ambas enzimas tuvieron su óptima de especificidad en pH 8. De manera sorprendente, la evolución de las curvas revelaron valores de pKa idénticos en el rango ácido de 7.17 + 0.02 y 7.15 + 0.02 para QC humana y de papaya, respectivamente. La reducción de la actividad de QC humana en valores pH básicos se debió obviamente a la disociación de un grupo con un pKa de aproximadamente 8.5. En caso de QC de papaya, no hubo colección excesiva de punto de datos en el rango de pH básico posible para permitir una determinación confiable del segundo valor pKa. Esto se soporta por ajuste de los datos a un modelo de disociación única, dando como resultado un valor pKa casi idéntico (pKa 7.1 3 + 0.03) en comparación al ajuste de los datos a un modelo de disociación doble. Esto indica que tanto ambos valores pKa casi se separan.

Estabilidad de pH La estabilidad de las ciclasas de glutaminil se investigó al incubar las enzimas de planta y de animal a 30°C por 30 min. a diferentes valores de pH entre pH 4-10. De allí, la actividad de QC se determinó bajo condiciones estándares. Los resultados se muestran en la Figura 3. La QC de látex de papaya fue estable en el rango de pH estudiado, sin una tendencia obvia para la inestabilidad en el rango básico o ácido. En contraste, la QC humana solamente mostró una estabilidad comparable en el rango de pH entre 7 y 8.5 , mostrando una inestabilidad notable a valores de pH arriba de pH 8.5 y debajo de pH 6. De esta manera, la región aproximadamente pH 8 parece ser óptima para la actividad y estabilidad de QC de planta y humana y un valor pH adecuado para realizar una comparación de especificidad de sustrato de las QCs.

Ejemplo 5: Determinación de la especificidad de sustrato de QC Ensayo Espectrofotométrico El ensayo espectrofotométrico continuo se realizó seg ún se describe en el ejemplo 2. De acuerdo con lo anterior, la actividad de QC se refleja por una reducción en absorción a 340 nm originada por la liberación de amon io y consumo subsecuente de NADH/H+ debido a la formación de glutamato de ácido a-cetoglutárico. Según se muestra en la Fig ura 1 , las curvas de avance lineal se monitorearon y hubo una relación lineal entre la actividad medida y la concentración de QC. Además , los parámetros cinéticos obtenidos para H-GIn-GIn-OH utilizando el ensayo continuo presentados aquí (Tabla 1 ) se encontraron en buen acuerdo con aquellos obtenidos utilizando el método discontinuo (KM= 175+18 µ?, kcat=21 .3+0.6 s~1 ). Además, los parámetros cinéticos para la conversión de los sustratos H-GIn-Ala-OH, H-GIn-Glu-OH , H-GIn-GIn-OH , H-GIn-OtBu y H-Gln-NH2 por QC de papaya mostrada en la Tabla 1 corresponden bien a aquellos determ inados utilizando un método directo a pH 8.8 y 37°C (Gololobov, M. Y. et al. 1 996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398) .

De allí, es casi obvio que el nuevo ensayo continuo proporcione resultados confiables.

Subrogados Di-. Tri- y Dipéptido Utilizando el nuevo ensayo continuo anteriormente descrito, aproximadamente 30 compuestos se probaron como sustratos potenciales de QC de C. papaya y humana. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Por comparación de las especificidades se mostró, que casi todos los sustratos de péptido corto se convierten más eficazmente en QC de papaya en com paración a la enzima humana. De manera interesante, para ambos sustratos de enzimas con grandes residuos hidrofóbicos en la segunda posición son más potentes según se muestra por las especificidades de H-GIn-Tyr-Ala-OH, H-Gln-Phe-Ala-NH2 y H-Gln-Trp-Ala-NH2 en comparación a aquellas de otros péptidos o por las reacciones de los sustratos de dipéptido. Para la QC de papaya, este descubrim iento es un acuerdo con cualquiera de los resultados que muestran que la especificidad se encuentra en correlación con el tamaño del segundo residuo de aminoácido (Gololobov, . Y. ef al. 1 996 Biol Chem Hope Seyler 377\ , 395-398) . La única diferencia de choque en la especificidad de la QC de animal y planta se observó en el caso de H-GIn-OtBu. Mientras que el éster se convirtió por QC de papaya con especificidad en comparación a los sustratos de dipéptido, se convirtió aproximadamente un orden de magnitud más lento por QC humana.

Oligopéptidos Además de los diversos oligopéptidos y tripéptidos, un número de oligopéptidos se probó en la conversión para QC humana y de papaya (Tabla 5). De manera interesante, la diferencia global en las especificidades entre la QC de planta y humana par un grupo de tetrapéptidos no fue tan grande como la que se observó para los sustratos de dipéptido y tripéptido. Esto indica que los aminoácidos en la 3a y 4a posición todavía afectan el comportamiento cinético especialmente de QC humana. Sin embargo, una excepción, comprende los péptidos con un residuo de prolina en la segunda posición de aminoácido que muestran valores kcat/KM notablemente reducidos en un grupo de tetrapéptidos de la estructura H-Gln-Xaa-Tyr-Phe-NH2 (Tabla 5). La reducción en la especificidad se pronunció más para QC humana, conduciendo a una diferencia aproximadamente de 8i veces en el valor kCat/ M según se compara a la QC de papaya.

Las especificidades ligeramente reducidas de QC humana también se observaron para la conversión de sustratos con un aminoácido positivamente cargado de terminal C de glutamina, según se indica por las especificidades para H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2l H-GIn-Arg-Tyr-Phe-NH2 y H-Gln-Lys-Arg-Leu-NH2 según se compara a otros tetrapéptidos. Aparentemente, la especificidad reducida se debió principalmente a un número de cambio más pequeño. Este efecto no fue el caso para la enzima de planta.

Tabla 6: Evaluación cinética de sustratos de péptido de QC humana y de papaya (n.r. no relativo; n.i., no inhibición; n.d.: no determinado; *, para inhibición de sustrato) Los resultados obtenidos con los tetrapéptidos dan también aumento a otra conclusión. Como ya se señaló, la QC de papaya mostró una selectividad más alta para dipéptidos. Para algunos de los tetrapéptidos , sin em bargo, se observaron constantes de especificidad más altas con QC humana, según se muestra en la Figura 4 proporcionando un diagrama de los datos dados en la Tabla 5, para un grupo de péptidos que contienen glutamato en la segunda posición de aminoácido. Además, a medida que la longitud de cadena aumenta de di- a tetrapéptidos, la selectividad de QC humana aumenta, en contraste a los resultados obtenidos con QC de papaya. Adicionalmente, la selectividad más alta de QC humana se registró para los péptidos conteniendo residuos hidrofóbicos voluminosos en la 3a y 4a posición de aminoácido, los cuales indican interacciones hidrofóbicas con la enzima. Por comparación de los parámetros cinéticos para los . péptidos respectivos, los cambios parecen deberse principalmente a los valores KM inferiores, los números de cambios para la conversión de los péptidos se encontró que fueron similares. De esta manera, la selectividad más alta de QC humana para péptidos más largos se considera que es el resultado de la unión más estrecha de los sustratos más hidrofóbicos a la enzima. Las diferencias entre la QC humana y de planta con péptidos que contienen aminoácidos hidrofóbicos en la 3a y 4a posición llegan a ser evidentes por una comparación de las constantes de especificidad de las enzimas hacia H-GIn-Arg-Gly-lle-NH2 y H-Gln-Arg-Tyr-Phe-NH2 o H-GIn-GIn-OH y H-Gln-Gln-Tyr-Phe-OH. La QC humana también se encontró que era más selectiva para sustratos homólogos que contienen Gln de N-terminal y un número creciente de residuos Ala de C-terminal (Tabla 6). Mientras que la selectivita de QC humana aumentó con la longitud de sustrato, no hubo tal tendencia con la QC de papaya. Ya que la QC humana fue menos específica para un péptido que contiene un residuo Ser en la secuencia, también la naturaleza de la cadena lateral parece ser de importancia (Tabla 6).

Tabla 7: Influencia de longitud de sustrato sobre la actividad de QC humana y de papaya Influencia de resistencia iónica en catálisis Otro parámetro que se investigó concerniente a su influencia en la especificidad de sustrato fue la resistencia iónica. Para ese propósito, los parámetros cinéticos para la ciclización de varios sustratos se determinaron en la presencia y ausencia de 0.5M de KCI (Tabla 7). De manera sorprendente, la selectividad de sustratos con elemento principal sin cargar no cambió de manera importante por adición de la sal en el caso de QC de látex de papaya y QC humana. Las constantes de especificidad de la QC humana para H-GIn-Ala-OH y H-GIn-Glu-OH, sin embargo, se redujeron por adición de KCI. Según se indica por los parámetros cinéticos individuales, este efecto se debió a un K creciente y un único valor kcat ligeramente reductor. En caso de la QC de papaya, no hubo efecto en ningún parámetro detectado. El efecto no pareció deberse al sustrato negativamente cargado como tal, ya que los parámetros sin cambiar se encontraron para el péptido negativamente cargado H-GIn-Glu-Asp-Leu-NH2. Un efecto interesante de la adición de sal se encontró para los sustratos positivamente cargados H-Gln-Arg-Gly-lle-NH2 y H-GIn-Lys-Arg-Leu-NH2. En caso de QC humana y de planta, un efecto positivo en catálisis se determinó principalmente debido a un valor KM pequeño y un número de cambios ligeramente más alto.

Tabla 8 : Infl uencia de resistencia ión ica en catálisis de QC humana y de papaya Sustratos Fisiológicos En los estudios tempranos, la conversión de [Gln ]-TRH y [Gln1]-GnRH por QC ya se mostró para la QC de pituitaria de bovino y porcino (Busby, W. H . J . et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H . y Spiess, J . 1 987 Proc Nati Acad Sci U S A 84, 3628-3632). Además de estas hormonas pituitarias ya investigadas, tres sustratos fisiológicos potenciales de QC humana se sintetizaron y se probaron en la conversión, principalmente [Gln ]Gastrina, [Gln1]Neurotensina, y [Gln1]FPP. Los parámetros cinéticos para su conversión se enlistan en la Tabla 1 . De manera interesante, los péptidos de glutaminil se convierten en los péptidos de piroglutamil respectivos con constantes de especificidad crecientes dependiendo de su tamaño, es decir, el primer péptido más grande pro-gastrina con 17 aminoácidos seguido por pro-neurotensina, pro-GnRH , pro-TRH y pro-FPP. Estos descubrimientos corresponden a los datos obtenidos con los péptidos sintéticos . De manera sorprendente, los sustratos más grandes tam bién se convierten con selectividad más alta por la enzima de planta, un resultado que contrasta en parte con los descubrimientos para los oligopéptidos más cortos. Posiblemente, existen interacciones de unión secundarias entre el sustrato y la enzima más distante del sitio activo.

Péptidos que comprenden aminoácidos modificados A fin de investigar más la especificidad y selectividad de las QCs, los péptidos se sintetizaron comprendiendo ya sea un residuo glutaminil de N-terminal modificado o un aminoácido modificado en la segunda posición. La conversión de estos péptidos se investigó cualitativamente utilizando espectrometría de masa ALDI-TOF (véase también ejemplo 3). Debido a la ciclización di residuo de glutaminil o su análogo, respectivamente, una diferencia de masa del sustrato y el producto de catálisis se detecta. En casos de liberación de amonio de un mol por mol de sustrato, la conversión tam bién se analizó cuantitativamente utilizando el ensayo espectrofotométrico. H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2. Este péptido ramificado de N-terminal , comprendiendo dos residuos de glutaminil en la N-terminal que se unen a un residuo lisilo por medio de un enlace de isopéptido parcial y péptido, se convirtió por QC humana (Figura 5) y de papaya (no mostrada) en una manera aparentemente idéntica. Ambos residuos de glutaminil se convirtieron en ácido piroglutámico, sin ninguna preferencia detectable para un residuo distinto, según se indica por la conversión de sustrato consistente (Figura 5) . De esta manera, la selectividad de las QCs para los residuos de glutaminil unidos de manera diferente difiere no fundamentalmente. H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. El residuo de glutaminil metilado solamente se convirtió en un residuo de piroglutaminil por QC de papaya (Figura 6) . Adicionalmente, una inhibición de la QC humana por el péptido no se detectó, indicando que el residuo metilado no se reconoce por QC humana. H-Glu(OMe)-fiNA y H-Glu-ß??. Ninguno de estos compuestos se convirtieron por QC humana o de papaya. Estos sustratos fluorogénicos se analizaron de manera fluorométrica, utilizando aminopeptidasa de piroglutamil como enzima auxiliar. Sin embargo, el residuo de glutamato O-metilado , mostró una inestabilidad notable en ambos reguladores Tris y Tricita tendiendo a una ciclización no enzimáticamente catalizada. Además, la actividad de ambas QCs contra H-GIn-AMC como sustrato no se inhibió por péptidos más largos H-Glu(OMe)-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2 o H-Glu-Phe-Lys-Arg-Leu-Ala-NH2, indicando que el ácido glutámico o derivados no se reconocen por ambas formas de QAC. Además , el resultado implica q ue no solamente la carga negativa del residuo de ácido glutámico es la razón para la repulsión del péptido del sitio activo. H-Gln-ciclo(Ns-Lys-Arg-Pro-Ala-Gly-Phe). La conversión de H-Gln-ciclo(Ns-LyS'Arg-Pro-Ala-Gly-Phe) , la cual contiene un enlace de isopéptido parcial intramolecular se analizó cuantitativamente, revelando los valores M de 240 + 14 µ? y 1 33 + 5 µ? para QC humana y de papaya, respectivamente. Debido al número de cambio más alto de conversión por QC de papaya (49.4 + 0.6 s" ) en comparación a QC humana (22.8 + 0.6 s"1 ) , la enzima de planta se m uestra con 372 + 9 mM" min"1 un valor kcat/KM aproximadamente 4 veces más alto que la QC humana. De esta manera, la constante de especificidad en caso de la QC de papaya solamente ligeramente más pequeña en comparación a los sustratos que tienen un tamaño similar, tal como H-GIn-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala- NH2. El valor kCat M para QC humana, sin. embargo , se encontró con 95 + 3 mM"1 s"1 q ue es aproximadamente un orden de magnitud más pequeña en com paración con sustratos de tamaño similar (Tabla 5) . H-/3homoGln~Phe-Lys-Arg-Leu-AIa-NH2. El residuo ß-homoglutaminil de N-terminal se convirtió en un anillo lactam de cinco miembros por catálisis de QC humana y de papaya, respectivamente. La liberación concomitante de amonio se analizó de manera espectrofotométrica y por análisis MALDI-tof según se describe anteriormente. No hubo liberación de amonio detectada cuando la QC se omitió o hirvió, indicando una catálisis específica de la ciclización . De manera interesante, la QC de C. papaya (KM=3.1 +0.3 mM , kcat=4.0+0.4 s"1) y humana (KM=2.5+0.2 mM, kcat=3.5+0.1 s" ) catalizan la conversión de este péptido con valores kcat/KM casi idénticos de 1 .4+0.1 y 1 .3+0.1 mM"1s"1 , respectivamente. De esta manera, la ciclización del residuo ß-homoglutamina se cataliza con una eficiencia reducida aproximadamente 1000 veces en comparación a los péptidos de tamaño similar conteniendo un residuo de glutaminil en su N-terminal. Esto muestra que la constitución del a-carbono del sustrato es importante para el reconocimiento de sustrato por las formas de QC, pero no esencial. El requisito esencial para ser un sustrato es un grupo ?-amida y un grupo amino de N-terminal no protonizado en distancia y áng ulo propenso para ciclización, un requisito que se cumple por los residuos de glutaminil de N-term inal y ß-homo-g lutam inil.

Ejemplo 6. Síntesis de los sustratos de QC Oligopéptidos. Los péptidos se sintetizaron semiautomáticamente en escala de 0.5 mmol utilizando un sintetizador de péptido (Labortec SP650, Bachem, Suiza) como se describe previamente (Schilling , S. et al. 2002 Biochemistry 41 , 10849-10857) . Los péptidos más largos se sintetizaron en escala de 25 //mol utilizando el sintetizador de péptido Symphony (Ranin Instrument Co. ) según se describe (Manhart, S. et al. 2003 Biochemistry 42, 3081 -3088) . Para todos los acoplamientos de péptido los protocolos de Fmoc modificados de síntesis de péptido de fase sólida se em plearon utilizando tetrafluoroborato 2-(1 H-Benzotriazol-1 -il)-1 , 1 , 3, 3-tetrametiluronio (TBTU; Novabiochem)/base (diisopropil etilamina o N-metil-morfolina; Merck) o en caso de acoplamientos difíciles W-óxido de hexafluorofosfato A/-[(Dimetilamino)-1 HA ,2, 3-triazolo[4,5-b]piridin-1 -ilmetileno]-A/-metilmetanam inio (4, 5) (HATU ; Applied Biosystems)/diisopropil etilamina como reactivos de activación , se utilizaron. Después de la división de la resina por ácido trifluoroacético (TFA; Merck) que contiene cocktail, los péptidos crudos se purificaron por H PLC preparativa con solventes libres de ácido a fin de evitar mayor ciclización de la g lutamina de N-terminal. La HPLC preparativa se realizó con un gradiente lineal de acetonitrilo (Merck ) en agua (5-40% o 65% de acetonitrilo durante 40 min) en una columna 250-21 Luna RP18 (Phenomenex) . Para confirmar la pureza de péptido y H PLC analítico de identidad y ESI-MS , se empleó. Glu(NH-NH2)-Ser-Pro- Thr-Ala-NH2, El péptido precursor lineal (Fmoc-Glu-Ser-Pro-Thr-Ala-N H2) se sintetizó de acuerdo a los procedimientos Fmoc estándares (Schilling , S. et al. 2002 Biochemistry 41 , 10849-10857) en resina MBHA amida Rink (Novabiochem) . Después de la división del péptido protegido por Fmoc de la resina, el péptido se precipitó con dietiléter (Merck), se filtró y se secó. La resina HMBA-AM (1 . 16 mmol/g, Novabiochem) se utilizó para acoplamiento del ácido ?-carboxílico de ácido glutámico del péptido precursor (3 eq.) en diclorometano (DCM , Merck) . Diciclohexilcarbodiim ida (DCC, Serva) (4 eq.) y dimetilaminopiridina (DMAP, Aldrich) (0.1 eq .) se utilizaron como reactivos de acoplamiento. Después de 1 2 .horas la resi na se filtró, se lavó con DCM y la reacción se repitió. Después de la desprotección del grupo Fmoc de N-terminal al emplear 20% de piperidina en DMF (3 x 5 min) la resina de péptido se trató con un 5% de solución de hidracina (20 m l/g) por 1 .5 horas. La resina se filtró y se lavó con dimetilformamida (DMF, Roth, Alemania) y TFA. Siguiendo la evaporación , el péptido crudo se precipitó con éter dando 76% de producción . H-Gln-Lys(Gln)-Arg-Leu-Ala-NH2. El péptido lineal se sintetizó de acuerdo al procedim iento Fmoc/'Bu estándar en MBHA amida Rink (Schilling , S . ef al. 2002 Biochemistry 41 , 1 0849-1 0857) utilizando Fmoc-Lys(Fmoc)-OH como el penúltimo acoplamiento de aminoácido. Después de la desprotección de los dos grupos protectores amino de lisina con 20% de piperidina (Merck) en DMF, 4 eq. De Fmoc-GIn(Trt)-OH se acoplaron. El procedimiento de división estándar dio como resultado 95% de producción. H-Gln-(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2. Fmoc-Gln(NMe)-OH se sintetizó comenzando de Fmoc-Glu-OtBu cargado en resina Fmoc-MI-AM (Novabiochem). Después de la absorción con DCM, la resina (0.5 g) se lavó con DMF y se desprotegió con 20% de solución de piperidina en DMF. La resina se dio en 5 mi de DMF y 5 eq. de Fmoc-Glu-OtBu, 5 eq. de HATU y 1 0 eq. de DI PEA se agregaron subsecuentemente y se agitaron por 6 horas. Después de la filtración y lavado, el producto se dividió de acuerdo a las condiciones de división de TFA estándar. El péptido H-Gln(NMe)-Phe-Lys-Ala-Glu-NH2 se sintetizó según se describe (Schilling, S. et al. 2002 Biochemistry 41, 10849-10857). Fmoc-Gln(NMe)-OH se acopló con HATU/DIPEA durante la noche. El procedimiento de división estándar dio como resultado 78% del péptido crudo. H-Glu(OMe)-fi-naftilamida, H-GIn- Val-OH, H-GIn-Tyr-OH. Los dipéptidos protegidos por Boc se sintetizaron aplicando el procedimiento de anhídrido mezclado estándar al utilizar clorocarbonato de isobutilo (Merck). Los metilésteres de C-terminal Boc-Gln-Tyr-OMe y Boc-GIn-Val-OMe se saponificaron por 1 N de NaOH en dioxano. Los péptidos protegidos por Boc se desprotegieron por solución de HCI/Dioxano por 10min. Después de la evaporación el residuo se cristalizó con varios solventes dando 60-70% de un compuesto sólido. H-Gln-ciclo(Ns-Lys-Arg-Pro-Ala-GIy-Phe). El precursor lineal Boc-Gln (Trt)-Lys-Arg(Pmc)-Ala-Gly-Phe-OH se sintetizó en resina 2-clorotritil sensible ácida. El acoplamiento se llevó a cabo utilizando un protocolo estándar de Fmoc/'Bu-estrategia utilizando Fmoc-Lys(Mlt)-OH . Después de la división con 3% de solución de TFA en DCM ( 1 0 veces 5 min[), la solución se neutralizó con 1 0% de piridina (Merck) en metanol (MeOH ; Merck), se lavó 3 veces con DCM y MeOH , se evaporó a 5% del volumen y el péptido crudo se precipitó con agua fría. Enseguida, el péptido crudo se sometió a ciclos utilizando la activación de DCC/A -hidroxibenzotriazol (HOBt; Aldrich). El péptido crudo se disolvió en diclorometano seco (0.2 mmol/50 mi), 0.2 mmol de N-metilmorfolina y 0.4 mmol de 1 - idroxibenzotriazol se agregaron . Esta solución se agregó gota a gota a una solución de 0.4 de diciclohexilcarbodiimida en 250 mi de diclorometano a 0°C. La reacción se completó al agitarse durante la noche a temperatura ambiente. Después de la filtración de ?/, /V'-dciclohexilurea, el solvente se removió por evaporación . El residuo se disolvió en etilacetato y se lavó varias veces con 1 N de HCI , solución saturada de NaHC03 y agua. La solución se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró y se evaporó para resequedad al vacío.

Ejemplo 7: Caracterización de efectores de QC Derivados de I midazol Los derivados de imidazol y bencimidazol que llevan sustituyentes en diferentes posiciones del anillo de 5 miem bros se probaron como inhibidores de QC (Tabla 3) . La constitución de los números se refiere al anillo imidazol. Los métodos aplicados se describen en el ejemplo 2. Derivados C-4(5) y C-4, 5. Los com puestos que llevan sustituciones ya sea en la 4- o 5- posición constitutivamente equivalente del anillo imidazol o en ambas posiciones mostraron un apotencia disminuida para la inhibición de QC humana. La única excepción , sin embargo, comprendió que la histamina N-co-acetilada se probó que fue uno de los compuestos inhibidores más potentes. Los sustituyentes pequeños en estas posiciones tuvieron solamente poco efecto en la unión según se indica por la constante de inhibición similar de 5-hidroximetil-4-metil-imidazol en comparación a imidazol. Los grupos grandes y más voluminosos unidos a estos sitios disminuyeron o cancelaron la unión del compuesto por la enzima. Algunos de los otros sustituyentes probados se conocen por ejercer efectos mesoméricos o inductivos negativos que son capaces de reducir la densidad electrónica en el anillo im idazol, lo cual también contribuye a las constantes de unión más escasas. La diferencia en los valores K¡ de L-histidina e histidinamida también indica alguna influencia de la carga en la unión . La evidencia para la repulsión electrostática de sustratos cargados ya se mostraron en los estudios de especificidad de sustrato, es decir, la glutaminamida se convirtió fácilmente en productos para QC humana, pero no se observó reactividad para glutamina libre como sustrato. Derivados C-2. Todos los derivados probados inhibieron QC más débilmente como imidazol. Cualquier sustitución mayor a la unión de QC adecuada de obstáculos protónicos. Solamente debido al grupo metilo en 2-metil-bencimidzol, la constante de in hibición cae aproximadamente un orden de magnitud. Una relación muy sim ilar se mostró por comparación de los valores K¡ para bencimidazol y 2-amino-bencimidazol. Adicionalmente, los resultados indican que la influencia no se refiere a alteraciones electrónicas. Derivados N- 1. Entre los derivados de imidazol probados en la inhibición de QC humana, la mayoría de los compuestos que tuvieron valores K¡ mejorados en comparación a imidazol mostraron alteraciones en un átomo de nitrógeno. Estos compuestos también contuvieron solamente uno de los inhibidores de QC más eficaces, 1 -bencimidazol. De manera importante, solamente pocas alteraciones de esta estructura condujeron a una pérdida de calidad inhibidora, según puede observarse para 1 -benzoimidazol y fenilimidazol , que fue inactivo bajo las condiciones experimentales. También en este caso, los cambios observados parecieron no originarse solamente por una densidad electrónica reducida del anillo imidazol debido al efecto mesométrico negativo del g rupo Fenilo, sino también al grupo trimetil-silil volum inoso, mostrando un efecto inductivo positivo mostró la unión reducida en comparación a otros residuos. De manera importante, solamente uno de los compuestos menos eficaces de este grupo fue 1 -am inopropil-im idazol. La poca eficacia de este compuesto se origina por el grupo amino básico, ya que los compuestos estéricamente similares 1 -metilimidazol y 1 -vinilimidazol mostraron unión mejorada para el sitio activo. De esta manera, el grupo amino positivamente cargado cuenta para el valor K¡ más pequeño, un resultado que se caracteriza por una comparación de los valores K¡ de histamina ?-?-acetilada (Tabla 3) e histamina (Tabla 4) . Efecto de 3, 4 y 3, 5 derivatización. Los derivados de imidazol que contuvieron sustituyentes en posiciones 4(5) o ambas se mostró que tuvieron una eficiencia restringida para la unión a la enzima. El efecto de las sustituciones específicas se especificaron por comparación de las constantes inhibidoras de L-histamina y los dos intermediarios en la degradación biológica de histamina, 3-metil- 4- histamina y 3-metil-5-histamina (Tabla 4). L-histamina reveló un valor K¡ que fue de aproximadamente un orden de magnitud más pequeño en comparación a su contraparte acetilada. La metilación de un nitrógeno dio como resultado una mejora considerable de eficacia en caso de 3-metil-4-histamina. La metilación que conduce a 3-meti- 5- histamina, sin embargo, dio como resultado la pérdida completa de actividad inhibidora. De esta manera, el efecto observado parece que se originó principalmente por un estorbo esférico de unión debido a la derivación del carbono adyacente al nitrógeno básico. Presuntamente, el nitrógeno básico juega un papel clave para la unión a la enzima.

Ejemplo 8: Formación de derivados ?ß-((3-40/42)) Las mediciones se llevaron a cabo con dos secuencias de pépíido de N-terminal cortas de ?ß(3-40/42), [T??3]-?ß( 1 -1 1 )a (secuencia : DAQFRHDSG YE) y [Gln3]Ap(3-1 1 )a, q ue contienen una glutamina en l ugar de un residuo de ácido glutámico en la tercera posición . La división por DP IV y ciclización del residuo e glutamina de N-terminal por QC de los dos péptidos se probó utilizando espectrometría de masa MALDI-TOF. Las mediciones se llevaron a cabo utilizando DP IV purificado (riñon de porcino) u homogenato de pituitaria de porcino crudo como fuentes de QC así como también para ambas enzimas para mediciones de catálisis consecutiva.

Resultados 1 . Formación de [T??3]?ß(3-1 1)? de [Gln3]Afi1-1 1 a catalizados por DPIV y sus prevención por el inhibidor de DP IV Val-Pirroliduro (Val-Pyrr) DPIV o la actividad tipo DPIV está dividiendo [T??3]?ß1 -1 1 a bajo la formación de [Gln3]Ap(3-1 1 )a (Figura 7). El residuo en la tercera posición no se cubre por esta división y llega por lo tanto a ser inaccesible para la modificación por otras enzimas, es decir, QC. Según se espera, la catálisis puede preven irse com pletamente por Val-Pyrr (Figura 8). 2. Formación de [pGlu3]Afi(3- 11)a de [T??3]?ß(3- 1 1 )a por catálisis de QC en homogenato pituitario y prevención por 1 , 10-fenantrolina La ciclasa de gluíaminil presente en el homogenato de pituitaria de porcino cataliza la conversión de [Gln3]Ap(3-11 )a a [pGlu3]A (3-1 )a (Figura 9). La formación de [pGlu3]Ap(3-11)a se inhibió por adición de 1 ,10-fenantrolina (Figura 10). 3. Catálisis consecutiva de DPIV y QC dando como resultado la formación de [?T??3]?ß(3-11 )a y prevención por Val-Pyrr y 1,10- fenantrolina La formación de [pGlu3^(3- 1)a de [???3]?ß1-1 a tiene lugar después de la catálisis consecutiva por DPIV y QC, se mide en homogenato crudo de pituitaria de porcino con DPIV agregado de riñon de porcino (Figura 11). [pGlu3]Ap(3-11)a no se formó cuando el inhibidor de QC 1 , 10-fenantrolina (figura 12) o el inhibidor de DPIV Val-Pyrr se agregó (Figura 13). La apariencia ligera de [pGlu3]Ap(3-11)a se debe a la división de aminopeptidasa y siguiente a la ciclización del residuo de glutamina, también indicada por la formación de [Gln3]Ap(2-11)a. 4. Formación de [?T??3]?ß(3-11)a en homogenato de pituitaria cruda por catálisis de aminopeptidasa(s) Debido a la formación de [pGlu3]A3(3-11)a que no fue dependiente de la catálisis de DPIV, la degradación de [Gln3]Ap1-11a se investigó en homogenato de pituitaria cruda sin DPIV agregada (Figura 14). Según se espera de los datos en la sección 4, la formación de [?T???3]?ß(3-1 1 )a se observó. Los datos muestran que la degradación de [Gln3]Ap1 -1 1 a también puede catalizarse por aminopeptidasa(s), dando como resultado [pGlu3JAp(3-1 )a. De allí, los resultados muestran que la formación de piroglutamil es un punto final de la degradación de péptido de N-terminal en este tejido, soportando además el papel de QC en formación de placas.

Ejemplo 9: Cambio de [Gln3]A0(3-11)a; 3-21 a y 3-40 por QC humana recombinante Todos los péptidos derivados de [???3]?ß probados se convirtieron eficazmente por QC humana en las formas de piroglutamil correspondientes (Tabla 8). Debido a la escasa solubilidad de [Gln3]Ap3-21 a y [T??3]?ß3-40 en solución acuosa, las determinaciones se llevaron a cabo en presencia de 1 % de DMSO. La mejora solubilidad de [Gln3]A (3-1 1 )a, sin embargo, permitió el análisis cinético del cambio catalizador por QC en presencia y ausencia de DMSO (Tabla 8). Tomados juntos, la investigación de los péptidos ?ß y sustratos de QC con longitud en cadena de 8, 18 y 37 aminoácidos (véase Tabla 8) confirmó la observación de que la actividad de QC humana aumenta con la longitud de sus sustratos. De acuerdo con (o anterior, Gln -gastrina, Gln1-neurotensina, Gln1-GnRH son entre estos los mejores sustratos de QC tomando las constantes de especificidad en cuenta. De igual forma, [Gln3]Ap3-40 y glucagon, los sustratos de QC más grandes investigados hasta ahora, mostraron constantes de tasa de segundo orden alto (449 mM"1s"1 y 526 mM"1s'1 respectivamente) aún en la presencia de 1 % de D SO (Tabla 8) . De manera interesante, los parámetros cinéticos para la conversión de los péptidos de amiloide investigados no cam biaron dramáticamente con el tamaño creciente, sugiriendo solamente efectos moderados de la parte de C-terimnal de ?ß en catálisis de QC . Por lo tanto , debido a la mejor solubilidad y manejo experimental, las investigaciones adicionales concernientes al procesamiento de aminopeptidasa de N-terminal de estos péptidos se realizaron utilizando los fragmentos más pequeños de ?ß , [T??3]?ß 1 -1 1 a, [Gln3]Ap(3-1 1 )a y ?ß(3-1 1 ) 3.

Tabla 9: Parámetros ci néticos para la conversión de péptidos que contienen Gin de N-terminal por QC humana recombinante en solución reguiadora que contiene 1 % de DMSO *Determinad o en ausencia de DMSO Ejemplo 10: Cambio de ?ß(3-11)ß y Afi3-21a por QC humana recombinante La incubación de ?ß(3- 1 1 )8 y ?ß3-21 8 en presencia de QC reveló q ue en contraste al trabajo previo, los péptidos que contienen glutamato también pueden servir como sustratos de QC (Figura 15C y D). La formación catalizada por QC de [pGlu3]Ap(3- 11)a y [pGlu3]A 3-21 a se investigó a pH 5.2 y 6.5, respectivamente. Si el inhibidor de QC bencimidazol se agregó a la solución antes de comenzar el ensayo por adición de QC, la conversión de sustrato que da como resultado [pGlu3]Ap(3-11 )a y [pGlu3]Ap3-21 a se suprimió (Figuras 15E y F). Si QC se hirvió antes de la adición, la formación de los péptidos de pGlu fue insignificante (Figuras 15 A y B).

Ejemplo 11: pH-dependencia de la ciclización catalizada por QC de papaya de Gln-ß?? y Glu-ß?? La QC de papaya convirtió Glu-j5NA en un rango de concentración hasta 2 m (la cual se limitó por solubilidad de sustrato) de acuerdo con cinética ichaelis-Menten (Figura 16). La inspección de cambio contra los diagramas de concentración de sustrato para la conversión catalizada por QC de Glu-/?NA, estudiada entre pH 6.1 y 8.5, reveló que para este sustrato Glu ambos parámetros, KM y kcat, cambiaron en una manera dependiente de pH (Figura 16). Esto es en contraste a la ciclización de glutamina catalizada por QC descrita, para la cual solamente los cambios en KM se observaron sobre el rango de pH dado (Gololobov, . Y. Song, I., Wang, W., y Bateman, R.C. (1994) Arch Biochem Biophys 309, 300-307). Por consecuencia, para estudiar el impacto de la concentración de protones durante la ciclización de Glu y Gln, la pH- dependencia de ciclización de glu-ß?? y Gln- ?NA bajo las condiciones de ley de tasa de primer orden (es decir, concentraciones de sustrato debajo de los valores KM) se investigó (Figura 17). La ciclización de glutamina tiene un pH óptimo a pH 8.0, en contraste a la ciclización de ácido glutámico que mostró un pH óptimo de pH 6.0. Mientras que las constantes de especificidad en el pH óptimo respectivo difieren aproximadamente 80,000 veces, la proporción de QC contra la actividad de EC aproximadamente pH 6.0, es solamente aproximadamente 8.000. La pGlu-formación no enzitnática de Gln- ?NA investigada en pH 6.0, se siguió por 4 semanas y reveló una constante de tasa de primer orden de 1.2*10"7s" 1. Sin embargo, durante el mismo período de tiempo, no se formó pGlu- ?NA de Glu-/?NA, permitiendo estimar una constante de tasa limitante para cambio de 1.0*10"9s~1.

Ejemplo 12: Procedimientos de Inactivación/Reactivación de Enzima Una alícuota de QC humana (0.1-0.5 mg, 1 mg/ml) se inactivo durante la noche por diálisis contra un exceso de 3000 veces de 5 mM 1 ,10-fenantrolina o 5 mM de ácido dipicolinico en 0.05 M de Bis-Tris/HCI, pH 6.8. Por consecuencia, el agente de inactivación se removió cuidadosamente por diálisis (3 ciclos, exceso de 2000 veces) de las muestras contra 0.05 M de Bis-Tris/HCI, pH 6.8, conteniendo 1 mM de EDTA. Los experimentos de reactivación se realizaron a temperatura ambiente por 15 minutos utilizando iones Zn++, Mn++, Ní++, Ca++, ?+ y CO++ a concentraciones de 1 .0, 0.5, 0.25 mM en 0.025 M de Bis-Tris, pH 6.8 conteniendo 0.5 mM de EDTA. Los ensayos de actividad de QC se realizaron en 0.05 M de Tris/HCI , pH 8.0, conteniendo 2 mM de EDTA, a fin de evitar una rápida reactivación por indicios de iones metálicos presentes en soluciones reguladoras. La inhibición de QC de porcino por 1 , 0-fenantrolina ya se ha descrito (Busby, W. H.J . et al. 1987 J Biql Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C.J. et al. 2001 Biochemistry 40). Sin embargo, el hecho de que EDTA se ha mostrado que tiene un efecto de activación en catálisis de QC sugirió que la inhibición por fenantrolina no se debe a la quelación de metal (Busby W. H.J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536, Bateman, R. C.J . eí al. 2001 Biochemistry 40) . También , además de inhibirse por 1 , 1 0-fenantrolina, la ciclización de sustrato catalizada por QC humana se evitó en presencia de ácido dipicolínico y 8-hidroxiquinolina, otros inhibidores de metaloenzimas. Estos q ueladores inhibieron la QC en una manera dependiente de tiempo y competitiva, es decir, la actividad inicial ya competitivamente inhibida se encontró que se redujo más después de la incubación prolongada con los compuestos (Figura 18, 19) . De manera importante, EDTA no mostró inhibición notable a pesar del tiempo de incubación o bajo cualquiera de las condiciones. La QC humana se inactivo casi completamente después de la diálisis extensiva contra 5 mM de 1 , 1 0-fenantrolina o 5 mM de ácido dipicolínico . Después de la diálisis repetida durante la noche contra las soluciones reguladoras libres de q uelador, la actividad de QC se reactivó parcialmente hasta 50-60% . Sin embargo, cuando se dializó contra los reg uladores que contienen 1 m M de EDTA, no se observó reactivación . La restauración casi total de la actividad de QC después de la inactivación ya sea por ácido dipicolínico o 1 , 1 0-fenantrolina se logró al incubar la proteína por 10 minutos con 0.5 mM de ZnS04 en presencia de 0.5 mM de EDTA (Figura 20) . La restauración parcial de la actividad de QC se obtuvo de igual forma utilizando iones Co++ y Mn++ para la reactivación. Aún en la presencia de 0.25 mM de Zn++ una reactivación de hasta 25% de la actividad original fue posible. No se observó la reactivación aplicando iones Ni++, Ca++, o K+. De igual forma, la incubación de QC completamente activa con estos iones no tuvo efecto en la actividad de enzima.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de un efector de ciclasa de glutaminil (QC) para la preparación de un medicamento para la modulación de la conversión de un ático glutámico o residuo de glutamina a un residuo de ácido piroglutámico en la N-terminal de al menos un sustrato QC seleccionado de Glu -ADan, Glu1-Abri, y Gln -Gastrinas (17 y 34). , 2. El uso según (a reivindicación 1 , en donde el efector se utiliza en combinación con al menos un vehículo y/o excipiente normal. 3. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la administración parenteral, entérica u oral. 4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la administración oral. 5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de cáncer duodenal con o c/o infecciones Heliobacter pylori, cáncer colorectal, síndrome Zolliger-Ellison, Demencia de Familia Británica y Demencia de Familia Danesa. 6. El uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el efector de QC tiene la fórmula general 1 : forouls l Incluyendo todas las sales farmacéuticamente aceptables y estereoisómeros del mismo; en donde R1 - R6 son independientemente H o una cadena de alquilo ramificado o no ram ificado, una cadena de alquenilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquinilo ramificado o no ramificado, carbocíclico, arilo, heteroarilo, heterocíclico, ácido aza-amino, aminoácido o un mimético de los mismos; todos los residuos antrioeres opcionalmente sustituyéndose y n puede ser 0-2. 7. Un método para la modulación de la conversión de un ácido glutámico o residuo de glutamina en un residuo de ácido piroglutám ico en la N-terminal de al menos un sustrato QC seleccionado de Glu -ADan , Glu1-Abr¡, y Gln1-Gastrinas (17 y 34) comprendiendo administrar a un mam ífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un efector de ciclasa de glutaminil (QC) . 8. El método según la reivindicación 7 para el tratamiento de una enfermedad seleccionada del g rupo que consiste de cáncer duodenal con o cío infecciones Heliobacter pylori, cáncer colorectal, síndrome Zolliger-Ellison, Demencia de Familia Británica y Demencia de Fam ilia Danesa. 9. El método según la reivindicación 8 en donde el mamífero es un humano. 10. El método según la reivindicación 9, en donde el efector de QC tiene la fórm ula general 1 : Incluyendo todas las sales farmacéuticamente aceptables y estereoisómeros del mismo; en donde R1 - R6 son independientemente H o una cadena de alquilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquenilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquinilo ramificado o no ramificado, carbocíclico, arilo, heteroarilo, heterocíclico, ácido aza-amino, aminoácido o un mimético de los mismos; todos los residuos antrioeres opcionalmente sustituyéndose y n puede ser 0-2. 1 1 . Un método para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de cáncer duodenal con o cío infecciones Heliobacter pylori, cáncer colorectal, síndrome Zolliger-Ellison, Demencia de Familia Británica y Demencia de Familia Danesa en un mamífero comprendiendo administrar a dicho mamífero una composición farmacéutica, en donde la composición farmacéutica es para la administración parenteral, entérica u oral y contiene al menos une fector de QC opcionalmente en combinación con vehículos y/o excipientes normales. 12. El método según la reivindicación 1 1 , en donde la composición farmacéutica es para la administración oral. 13. El método según la reivindicación 1 1 , en donde el efector de QC tiene la fórmula general 1 : Incluyendo todas las sales farmacéuticamente aceptables y estereoisómeros del mismo; en donde R1 - R6 son independientemente H o una cadena de alquilo ramificado o no ramificado, una cadena de aiquenilo ramificado o no ramificado, una cadena de alquinilo ramificado o no ramificado, carbocíclico, arito, heteroarilo, heterocíclico, ácido aza-amino, aminoácido o un mimético de los mismos; todos los residuos antrioeres opcionalmente sustituyéndose y n puede ser 0-2. RESU MEN La presente invención proporciona nuevos sustratos fisiológicos de ciclasa de g lutaminil de mamífero (QC , EC 2.3.2.5) , nuevos efectores de QC y el uso de tales efectores y composiciones farmacéuticas que comprenden tales efectores para el tratamiento de enfermedades q ue pueden tratarse por modulación de actividad de QC, por ejemplo, enfermedades seleccionadas del grupo que consiste de cáncer duodenal con o c/o infecciones Heliobacter pylori, cáncer colorectal , síndrome Zolliger-Ellison, Demencia de Familia Británica y Demencia de Familia Danesa.