MX2011005274A - Uso de un peptido antibiotico proveniente del veneno del alacran centruroides suffusus suffusus y sus composiciones farmaceuticas obtenidas con antibioticos comerciales. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un péptido denominado Css54 (SEQ ID NO: 1), con actividad antibiótica contra un cierto grupo de microorganismos, conteniendo 25 aminoácidos y con un peso molecular de 2,870.4 Daltones, que fue aislado y purificado a partir del veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus. Dicho péptido también puede ser obtenido por otros medios como síntesis química, o bien mediante la técnica del ADN recombinante. El péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) es de estructura secundaria alfa-lineal, la cual difiere de la estructura de otros péptidos, como los que presentan un estructura de hojas betas con puentes disulfuro, como del grupo de las betadefensinas. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas obtenidas que comprenden dicho péptido y opcionalmente en combinación con antibióticos comerciales como la Kanamicina, Estreptomicina, Isoniazida, Pirazinamida o la Rifampicina.

Description

USO DE UN PEPTIDO ANTIBIÓTICO PROVENIENTE DEL VENENO DEL ALACRÁN CENTRUROIDES SUFFUSUS SUFFUSUS Y SUS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS OBTENIDAS CON ANTIBIÓTICOS COMERCIALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un péptido con actividad an-tibiótica, particularmente contra un cierto grupo de microorganismos. Dicho péptido fue aislado y purificado a partir del veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus pero también puede ser obtenido por otros medios como síntesis química, o bien mediante la técnica del ADN recombinante. El péptido denominado en la presente invención como Css54 (SEQ ID NO: 1) es de estructura alfa-lineal, la cual difiere a otros péptidos de estructura de hojas betas con puentes disulfuro, como en el grupo de las beta-defensinas. La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden dicho péptido y opcionalmente otros antibióticos tales como kanamicina, estreptomicina, isoniazida, pirazinamida y rifampicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Resistencia a antibióticos La resistencia a los antibióticos es un mecanismo utilizado por las bacterias para disminuir o inactivar la acción de éstos agentes [1]. Año con año aumenta la resistencia a los antibió-ticos (AB) de varios patógenos, esto debido a su uso indiscriminado tanto en la práctica clínica como en la automedicación [2]. El uso indiscriminado de los agentes AB crea una presión de selección en las bacterias, provocando que se adapten a las nuevas condiciones del ambiente a través de la adquisición o expresión de nuevos genes de resistencia. A la fecha existen numerosos reportes que muestran un importante incremento en la tasa de aparición de genes resistentes a antibióticos, lo cual se ve reflejado en la propagación y recurrencia de diferentes enfermedades o infecciones a nivel mundial [3].

Existen dos tipos de resistencia antimicrobiana, la natural y la adquirida. La primera corresponde a una propiedad específica de algunas bacterias, mientras que la adquirida se genera por una mutación o cuando la bacteria adquiere un plásmido que contiene un gen de resistencia [1, 4]. Por ejemplo, se ha demostrado que la selección de microorganismos resistentes puede ocurrir durante o después de tratamientos con antimicrobianos y por el uso de antisépticos que se añaden a muchos productos de uso doméstico, cuyos residuos pueden establecerse en el medio ambiente durante períodos considerables después de su utilización [5]. Entre las estrategias bacterianas de resistencia a los antibióticos se encuentran la disminución de la permeabilidad, modificación del antibiótico, alteraciones del sitio donde los antibióticos ejercen su acción, entre otras [5, 6].

El creciente aumento de la resistencia a antibióticos por parte de muchos organismos patógenos ha motivado la búsqueda de nuevos compuestos naturales capaces de inhibir o inducir toxicidad a dichos organismos [7]. Actualmente, la batería de antibióticos disponibles se restringe de manera importante a productos colaterales de hongos, como la penicilina y otros simi-lares obtenidos de organismos unicelulares. El surgimiento de antibióticos de origen peptídico puede ser la clave para solucionar este problema, pues han evolucionado por millones de años y constituyen uno de los mecanismos más eficientes utilizados por varios organismos, desprovistos de anticuerpos, pa-ra contender con el ataque de microorganismos. Actualmente se conoce una gran variedad de antibióticos peptídicos, obte- nidos de diferentes fuentes como artrópodos, mamíferos y plantas [8-12].

Péptidos antimicrobianos Los péptidos antibióticos son posiblemente las moléculas más primitivas desarrolladas como barreras primarias de defensa y se han encontrado muchas familias de ellos tanto en plantas como animales superiores [10], aunque fueron aislados ini-cialmente en invertebrados [13]. En venenos de arácnidos el tamaño de estos péptidos oscila de entre 2,000 y 5,000 Da y una característica común de todos estos péptidos es su naturaleza básica debido a la presencia de varios residuos de Usina y arginina, además de su carácter antipático. Actualmente se proponen tres mecanismos de acción para la mayoría de ellos; 1) La formación de tapiz en la membrana de bacterias sugiere la formación de una capa de monómeros paralela a la superficie de la membrana capaz de perturbar la membrana fosfolipí-dica y consecuentemente desintegrar la membrana bacteriana [14]; 2) La formación de poro de barril transmembranal sugiere la formación de poros transmembranales por la agregación de dímeros o multímeros para formar una estructura de canal bajo la influencia de una fuerza electromotriz, por lo que se requiere una célula metabólicamente activa; si el poro no se repara, la célula muere debido a la depolarización de la membrana y la consecuente pérdida de iones [15]; y 3) La formación de poro de barril toroidal transmembranal sugiere la formación de un poro de barril pero los monómeros de péptidos antimicrobianos estarían intercalados con fosfolípidos de la membrana bacteriana [16].

El espectro de actividad antibiótica de los péptidos antimicrobianos es muy amplio, ya que afectan bacterias, proto- zoarios, hongos, y en ocasiones células eucariontes. Estos péptidos trabajan a altas concentraciones (1-50 µ?) en sitios locales, por lo que sus concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) son altas en comparación con otros antibióticos [17]. Además de su actividad antibiótica, ciertos péptidos también se han relacionado con la estimulación del crecimiento celular, cicatrización y estimación de la quimiotaxis de monocitos [18, 19].

Los péptidos antibióticos pueden dividirse en cuatro grupos; 1) Alfa-helicoidales, con o sin doblez; 2) Hoja beta-antiparalela, con 2 o más puentes disulfuro; 3) Estructuras helicoidales presentando doblez, estabilizadas por un puente de disulfuro; y 4) Estructuras con un alto contenido de ciertos aminoácidos como prolina/arginina, glicina o triptófano [10].

Los péptidos antibióticos básicamente se emplean en el tratamiento de infecciones, solos o con sustancias antisépticas (la patente norteamericana 5,656,591 describe un uso como antiséptico). La patente norteamericana 5,714,467 protege una familia de péptidos antibióticos híbridos que incluyen regiones hidrofóbicas e hidrofílicas de péptidos con actividad antibiótica tales como cecropinas, magaininas y melitinas, donde dichos péptidos tienen una mejor actividad biológica que los péptidos nativos que les dan origen, ya sea porque presentan una menor actividad lítica o porque presentan una mayor actividad an-tibiótica. Sin embargo, a diferencia de la presente invención, se trata de péptidos no naturales. Algunas otras patentes norteamericanas protegen la combinación sinérgica de ciertos antibióticos de origen peptídico con uno o más antibióticos ß-lactámicos y/o cloranfenicol (patente norteamericana 5,610,139) para uso farmacéutico.

Finalmente, la revisión de Nicolás y Mor [8] menciona el caso de la inhibición del desarro Ifo de lesiones cutáneas causadas por Treponema pallidum en un modelo de conejo, a los cuales se inyectó intradérmicamente soluciones de defensinas. Estos autores también mencionan el uso de las dermaseptinas como indicado en la cura de Leishmaniasis murina. Las magaininas fueron reportadas como eficientes en el tratamiento de tumores de ascitis peritoneal murino [20]. De hecho, las magaininas son actualmente utilizadas en la clínica, para uso tópico como antisépticos [17].

El veneno de alacranes y sus péptidos antibióticos Dentro del phylum Arthropoda , los alacranes son una de las especies terrestres más antiguas que se conocen. Su veneno contiene componentes neurotóxicos que afectan canales i ó n i -eos. La mayoría de estas toxinas muestran un motivo estructural común con las defensinas de insecto consistente en una hoja beta-plegada antiparalela ligada a una alfa-hélice anfipá-tica y a un fragmento amino-terminal unido por tres puentes de disulfuro [21], pero a diferencia de éstas, no presentan una ac-tividad antibiótica sino más bien una actividad tóxica a diferentes grupos de animales.

Hasta el momento se han aislado péptidos antimicrobianos tipo defensina de la hemolinfa de los alacranes Leiurus quinques-triatu y Androctonus australis [12, 22]. También existen repor-tes en la literatura sobre la presencia de péptidos bactericidas tipo alfa-lineal en el veneno de alacranes Hadrurus aztecus y Pandinus imperator.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Gráfica que muestra la separación por cromatografía del veneno de Centruroides suffusus suffusus. El componente marcado con la flecha presentó efecto antibiótico en contra de Staphylococcus aureus y Escherichia coli. El inserto en esta figura corresponde a la comprobación de su pureza por HPLC. Figura 2. Tabla que muestra la secuencia de aminoácidos del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1).

Figura 3. Comparación del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) con otros péptidos antibióticos. Acceso: se refiere al número asignado en el "Universal Protein Resource" (UniProt, http://www.uniprot.org/.

Figura 4. Gráfica que muestra la comprobación por HPLC de la identidad del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) sintético con el péptido nativo. a: Los datos representan los resultados de dos experimentos independientes.

Figura 5. Tabla que muestra la actividad antibiótica del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) contra las bacterias Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Candida albicans.

Figura 6. Gráfica que muestra la actividad hemolítica del péptido Css54. Dos péptidos con diferentes estructuras primarias fueron comparados, Css54 (SEQ ID NO: 1) y Pinin2 (ver figura 3)· Figura 7. Gráfica que muestra el dicroismo circular del péptido Css54(SEQ ID NO: 1). La longitud de onda se muestra de 180 a 260 nanometros y la absorbancia esta dada en ángulo de grados de rotación por cm2 entre decimoles.

Figura 8. Diagrama de Schiffer-Edmundson del péptido Css54. Los tonos de gris obscuro representan la región hidrofóbica y los tonos de gris claro la región hidrofílica.

Figura 9. Gráfica que muestra la actividad de Css54 (A) y el sinergismo del péptido Css54 con Pirazinamida (B), sobre Sfa-phylococcus aureus.

Figura 10. Gráfica que muestra el sinergismo del péptido Css54 con Isoniazida (C) y Rifampicina (D), sobre Staphyloco-ccus aureus.

Figura 11. Gráfica que muestra el sinergismo del péptido Css54 con Estreptomicina (E) y Kanamicina (F), sobre Staphy-lococcus aureus.

Figura 12. Tabla que muestra la actividad antibiótica del pép-tido Css54 (SEQ ID NO: 1) en combinación con antibióticos comerciales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se puede constatar en el estado del arte, existe el problema médico de que los antibióticos tradicionales presentan el inconveniente de que muchos microorganismos han desarrollado resistencia al embate de los mismos. Una alternativa general para enfrentar este problema es el uso de nuevos tipos de sustancias antibióticas, particularmente de péptidos antibióticos, que según se aprecia existen de muy variados orígenes, desde invertebrados hasta mamíferos, atacando diversos patógenos incluyendo bacterias, hongos y protozoarios. Dentro de esta tendencia y dado que hasta ahora existen pocos repor-tes en la literatura sobre la presencia de péptidos bactericidas en el veneno de alacranes. Particularmente en la presente invención se aborda el aislamiento de un péptido antibiótico a partir del veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus. Los inventores aportan como propuesta de solución al proble-ma de resistencia a antibióticos, el uso del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1), un péptido aislado y purificado que presenta una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, la cual es diferente a las secuencias de otros péptidos, incluyendo aquellos con actividad antimicrobiana, ya conocidos.

Inicialmente este péptido fue obtenido por aislamiento y purifi-cación a partir del veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus, que puede ser colectado en el estado de Durango, México, por lo que se ha resuelto llamarlo Css54 (SEQ ID NO: 1) ya que la fracción 54 resultó con actividad microbicida.

El veneno crudo del alacrán, Centruroides suffusus suffusus, se obtiene por estimulación eléctrica del telson o cualquier otro método conocido en el estado del arte [23]. El veneno es recuperado en agua bidestilada y centrifugado a 4 °C. El sobrenadante es liofilizado y conservado a -20 °C, hasta su uso. La separación y purificación de los componentes solubles del veneno se lleva a cabo por un método cromatog ráf ico conocido en el estado del arte como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), o bien cualquier otro tipo de método cromato-gráfico conocido en estado del arte [24].

De las fracciones obtenidas, se pueden continuar subsecuentes etapas de purificación de aquellas que presenten actividad antibiótica contra las bacterias preseleccionadas, como se muestra en la Figura 1. Se pueden emplear los diferentes mé-todos cromatog ráf icos conocidos en estado del arte como los antes mencionados, y con tantas etapas como sea necesario hasta obtener un compuesto único y puro. Para la caracterización química del péptido se determina su composición química, la cual se lleva a cabo mediante un análisis de aminoácidos del N-terminal del péptido, por ejemplo en un secuenciador automatizado LF3000 (Beckman, CA, USA) de secuenciación de péptidos (degradación de Edman) en membranas de unión co-valente Sequelon-AAR siguiendo los protocolos descritos por la compañía. El peso molecular de la fracciones con actividad microbicida se estima por espectrometría de masas. Las masas moleculares de los péptidos con actividad antimicrobiana fueron determinadas mediante ionización por electrospray (ESI-MS) usando un equipo Finnigan LCQDUO ion trap (San José, CA, USA) y mediante MALDI-TOF utilizando el equipo Bruker Daltonics Ultraflex MALDI TOF/TOF. La cuantificación del con-tenido de proteína durante los procedimientos cromatog ráficos se calcula asumiendo que una unidad de absorbancia a 280 nm equivale a 1 mg/ml de proteína. Debido a que el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) no contiene tirosinas ni triptófanos, la concentración verdadera del péptido para la curva dosis-respuesta en bacterias, se determinó con base en el análisis de aminoácidos de fenilalanina.

Para el secuenciamiento del N-terminal o determinación de espectrometría de masas se usó el péptido nativo para secuencia directa, así como los péptidos aislados por HPLC provenientes del rompimiento con la endopeptidasa Lys-C (Boehringer Man-heim), como se muestra en la Figura 2. Las digestiones se hacen con 50 µg de péptido cada vez disolviéndolo en amortiguador de fosfatos 50 mM pH 8.0, e incubándolo durante 4 horas a 37 °C usando una relación 1 :20 (enzima: péptido). El péptido Css54 (SEQ ID NO: 1 ) resulta tener la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. Sin embargo, resulta obvio para cualquier experto en el estado del arte que se puede realizar alguna sustitución, adición o eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia con la idea de incrementar el carácter básico, o bien algún otro aminoácido para incrementar la actividad del péptido, con lo que dicha modificación o mutación caería dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, modificaciones con substituciones del aminoácido Fenilalanina por Lisina en la posición 17 (F17K) del péptido antibiótico Css54 (SEQ ID NO: 1) podrían incrementar su actividad biológica [25].

El nuevo péptido antibiótico Css54 (SEQ ID NO: 1) de la presente invención tiene un peso molecular teórico de 2,870.4, un punto isoeléctrico calculado de 10.4 y carece de residuos de cisteína en su secuencia aminoacíd ica , lo cual facilita una buena síntesis química del péptido ya que no presenta estruc-tura tipo beta en su estructura secundaria. También resulta obvio para cualquier experto en el estado del arte que alguna modificación a la secuencia aminoacídica del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1), repercutiría directamente en los valores de peso molecular y punto isoeléctrico, sin que por ello el péptido modificado quede fuera del alcance de la presente invención. Las búsquedas en bancos de datos conteniendo secuencias aminoacídicas de proteínas mostraron de poca a mediana identidad con los péptidos antibióticos Ponericinas W1 , W2 y W5 de veneno de hormiga (40-60%); con el péptido antimicrobiano Pandinina 2 de veneno de alacrán y con los péptidos Gaegurin 5, Brevinin 1 y Pininin de secreciones de glándulas de piel de rana (20-41%) (Figura 3). El alineamiento y las comparaciones de las secuencias de aminoácidos se realizaron con el programa Clustal X. Al comparar el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1 ) con las Ponericinas (Figura 3), de las 25 posiciones generadas solamente 15 son identificadas lo que arroja una identidad de 60% entre estas secuencias completas; cuando comparamos el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) con la Brevinin 1 (Figura 3), se identifican 7 de los 25 aminoácidos generados, obteniéndose una identidad de 25%. Estos valores de identidad demuestran una diferencia entre el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) y los péptidos conocidos. De este modo Css54 (SEQ ID NO: 1 ) es un péptido que presenta cierta identidad (no mayor a 60%) con péptidos antibióticos de naturalezas distintas lo que le da la característica de ser un péptido natural, o bien híbrido de otros péptidos naturales y que se diferencia de los trabajos reportados en la patente norteamericana 5,714,467 principalmente en que los péptidos que describe tienen una secuencia diferente (identidad no mayor a 30 %) y que los péptidos que ésta protege son péptidos híbridos y no naturales como lo es el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1).

La estructura secundaria para el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) es alfa-helicoidal como es observada en el espectro de di-croismo circular (Figura 7). También se usó un diagrama de Schiffer-Edmundson [26] para predecir las regiones hidrofóbi-cas e hidrofílicas dentro de la estructura secundaria del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1 ). En el diagrama de Schiffer-Edmundson se observan dos regiones bien diferenciadas; una región hidrofóbica (en tonos gris obscuro) y otra región hidro-fílica (en tonos gris claro) (Figura 8). La Figura 8 muestra una conformación antipática alfa-helicoidal en la que los residuos hidrofóbicos e hidrofilícos se encuentran en lados opuestos de la región que comprende los primeros residuos del extremo amino terminal y del residuo 16 en adelante. Con el objeto de demostrar que la actividad biológica del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1 ) no es debida a la presencia de algún posible contaminante en la muestra, purificada a partir del veneno del alacrán, y que es factible obtener el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1 ) por métodos distintos al aislamiento y purificación a partir del veneno, se procede a sintetizar la molécula completa del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) por un método químico. Por ejemplo el descrito por los inventores en la patente nortéame- ricana 4,929,718, haciendo una síntesis de novo de la molécula de Css54 (SEQ ID NO: 1). Sin embargo es obvio para cualquier experto en el estado del arte que, con la secuencia SEQ ID NO:2 del ADN, el péptido Css54 de la presente invención puede también ser obtenido por otros métodos conocidos como los métodos del ADN recombinante.

El péptido Css54 (SEQ ID NO: 1), tanto obtenido por aislamiento del veneno del alacrán como el sintético, fue probado en su actividad antibiótica contra diferentes microorganismos, seleccionados de modo de representar los grupos de diferentes patógenos, algunos de ellos conocidos por elevada virulencia o por su alta resistencia a los antibióticos clásicos, mediante la medición del crecimiento celular en cultivos líquidos incubados con diferentes concentraciones del péptido, sin que esto limite el alcance de la presente invención sobre otros posibles microorganismos patógenos. Los microorganismos seleccionados en la presente invención fueron Pseudomonas aeruginosa , Es-cherichia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Staphy-lococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Candida albi-cans. En todos los casos el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) demostró tener actividad antibiótica.

El hallazgo del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) en el veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus, su aislamiento, síntesis y demostración de su actividad antibiótica es un nueva in-vención, distinta de lo encontrado en la hemolinfa de los alacranes Norte-Africanos mencionados en la literatura, los cuales contienen particularmente defensinas. Además el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) se diferencia de otros péptidos antimicrobianos provenientes del veneno de alacrán en que el pépti-do Css54 (SEQ ID NO: 1) es el único que contiene 25 residuos de aminoácidos con una secuencia única, la cual es solamente idéntica en un 41% a un péptido antimicrobiano proveniente del veneno de alacrán Pandinus imperator [27].

Otro aspecto que contempla la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) como único antibiótico o bien como en combinaciones con antibióticos comerciales, particularmente donde las mezclas resultantes tienen un efecto sinérgico sobre las bacterias de importancia clínica.

La composición farmacéutica puede ser elaborada conforme a la vía de administración que se desea emplear, lo cual incluye composiciones sólidas (como tabletas, cápsulas, pildoras, óvulos, polvos y granulados con o sin capa entérica) para administración oral o vaginal, composiciones líquidas para administración oral, oftálmica o para inhalaciones y aplicaciones en vías respiratorias, tales como soluciones, suspensiones, jarabes o elixirs. Preparaciones para administración parental como soluciones estériles, suspensiones o emulsiones. Las composiciones también pueden ser preparadas como sólidos estériles para ser disueltos antes de su uso en algún método inyectable estéril, tal como agua y solución fisiológica salina. Preferentemente, dado que también se encontró una actividad hemolíti-ca en el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1), se pueden utilizar composiciones para uso tópico tales como emulsiones, suspensiones, cremas, lociones, espumas o geles, los cuales pueden contener emolientes, agentes suspensores, quelantes, solidificantes y amortiguadores, así como cualquier otro componente típicamente utilizado en las composiciones tópicas de otros péptidos antibióticos.

Una composición farmacéutica preparada como se indica en la presente invención al ser administrada en cantidades terapéuticamente efectivas, a un mamífero afectado por una infección bacteriana debe causar una inhibición considerable al crecimiento de la bacteria causante de la infección, dando lugar a una mejora en el mamífero tratado. Preferentemente, la composición farmacéutica de la presente invención debe causar una inhibición al crecimiento de la bacteria causante de la infección, cuando se trate de un microorganismo sensible, como por ejemplo del grupo que consiste en: Pseudomonas aerugi-nosa, Escherich ia coli, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Candida albicans. Desde luego el régimen posológico empleado puede requerir modificar las concentraciones empleadas respecto a las que se reportan en la presente invención de acuerdo al tipo de composición farmacéutica, la vía de administración empleada, las características del mamífero al cual se le administraría tales como la especie, sexo, peso, edad, gravidez, dieta, la combinación con otros fármacos y la sensibilidad, así como del microorganismo que se desee atacar y algunos síntomas del padecimiento provocado.

Es obvio para cualquier experto en el estado del arte que el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1), el péptido de la presente invención, tiene un potencial uso farmacéutico o veterinario como antibiótico, sin embargo son posibles posteriores hallazgos respecto a otros nuevos usos o aplicaciones que pueda tener, sobre todo atendiendo a que su origen esté en un veneno de alacrán a diferencia de la gran mayoría de otros péptidos encontrados en el estado del arte, cuyo origen son las respuestas humorales inmunes de insectos y otros animales.

Resulta obvio para cualquier experto en el estado del arte que pueden generarse mutaciones puntuales conservativas (susti- tución de uno o más aminoácidos) en la SEQ ID NO: 1 que den lugar a una secuencia aminoacídica que conserve la misma función que la SEQ ID NO: 1 y que por tanto dichas mutaciones conservativas quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, el cambio del aminoácido Li-sina en posición 24 por Glutamina (K24Q) resulta en una actividad antibiótica similar a la de la SEQ ID NO: 1. También es obvio para un experto en el estado del arte que como lo reportan Kondejewski et al. [28] se puede orientar la acción de for-ma preferencial para matar o inhibir el crecimiento de bacterias y al mismo tiempo disminuir la acción lítica celular a tejidos de organismos superiores, mediante el cambio de perfil h¡-drofóbico de las moléculas, mediante mutaciones sitio-específicas (inserciones, sustituciones y deleciones de uno o más pares de bases) de tal forma que las variaciones en la secuencia aminoacídica modifiquen la polaridad de la molécula dando lugar a la obtención de una nueva generación de antibióticos que presenten mayor actividad antibiótica y menor actividad hemolítica, respecto al péptido nativo, y cuyas secuen-cias aminoacídicas sean derivadas y muy similares a la secuencia SEQ ID NO: 1 , quedando, por tanto, dentro del alcance de la presente invención.

Asimismo, como no existen receptores específicos para estos antibióticos en los microorganismos se pueden sintetizar pép-tidos con aminoácidos de estereoisomería D- en lugar de L-, y de esta forma impedir la destrucción del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) por acción de posibles proteasas bacterianas endógenas, y así aumentar la vida media del péptido en el organis-mo al que se haya aplicado [29], quedando dichos estereoisó-meros D del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) dentro del alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son dados a modo de ilustrar algunos de los modos para obtener o utilizar la presente invención. Es posible llevar a cabo muchas variaciones de los mismos sin salirse del alcance de la presente invención y por lo tanto de ninguna manera debería considerarse que la limitan de alguna forma los alcances de la presente invención.

Ejemplo 1. Aislamiento y purificación del Css54 (SEQ ID NO: 1) a partir del veneno del alacrán Centruroides suffusus suffusus .

El veneno crudo de Centruroides suffusus suffusus se obtuvo por estimulación eléctrica del telson de los alacranes colectados en el Estado de Durango, México. El veneno se recuperó en agua bidestilada y se centrifugó en una u Itracentrif uga Be-ckman OptimaTL por 15 minutos, a 4 °C y 15,000 g de acelera-ción. El sobrenadante se liofilizó y conservó a -20 °C, hasta su uso.

La purificación de los componentes solubles del veneno se llevó a cabo primeramente por cromatografía de alta presión. El veneno liofilizado se disolvió en una solución acuosa con 0.1% de TFA, y se aplicó directamente a la columna, obteniéndose el perfil mostrado en la figura 1. En esta separación se obtuvieron 60 fracciones, numeradas del 1 al 60, colectándose en tubos de 1.5 mi y agrupándose de acuerdo a la absorbancia (leída a 230 nm). La recuperación total fue del 85%, del cual aproximadamente el 0.05% corresponde a la fracción denominada 54, la cual fue la única capaz de inhibir el crecimiento de E. coli y S. aureus (seleccionados como cepas control), a las concentraciones utilizadas (5 por ensayo).

Soluciones posteriores del material de la fracción 54 (con el péptido Css54, SEQ ID NO: 1), en cantidades de alrededor de 20 microgramos por aplicación, fueron purificadas por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando una columna (Vydac) C18 analítica, en un aparato Waters 600E equipado con un detector de UV, modelo Waters-486, con un gradiente lineal de 0 a 60% de acetonitrilo, en presencia de 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA), durante 60 minutos, resultando el perfil cromatográf ico del inserto en la figura 1. Más de tres subf racciones fueron obtenidas como se puede observar en la figura 1 , en donde el componente marcado con la flecha (péptido Css54, SEQ ID NO: 1) mostró actividad antibiótica contra las cepa de E. coli y S. aureus. Este péptido corresponde al 0.01% del veneno total y fue sometido a un análisis de espectrometría de masas donde se demostró estar homogéneo y con un peso molecular de 2,870.4 Da.

Ejemplo 2. Síntesis química de Css54 (SEQ ID NO: 1).

Con el fin de ilustrar la posibilidad de obtener el péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) por otros medios distintos al aislamiento de la misma a partir del veneno del alacrán, se llevó a cabo una síntesis química de este péptido y se demostró su identi-dad con el péptido nativo. Para ello, se utilizó el método de fase sólida [30], mediante el uso de Fmoc-aminoácidos. Al final de la síntesis, el péptido se liberó de la resina por rompimiento con ácido TFA. El péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) sintético se purificó primeramente pasando por una columna semi-preparativa de cromatografía de alta presión, para eliminar contaminantes de bajo peso molecular y después por HPLC, usando una columna analítica C18, fase reversa, con un gradiente lineal de acetonitrilo de 30-60% en presencia de 0.1% de ácido trifluoroacético en 30 minutos. Con el objeto de caracterizar biológicamente en mayor medida este péptido para obtener un mayor espectro de actividad hacia bacterias de interés clínico se sintetizó y purificó a homogeneidad 50 mg del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1), obteniéndose un rendimiento final del 60% de péptido puro. En la figura 4 se presenta un cromatograma de una muestra del péptido Css54 nativa (SEQ ID NO: 1), tal como es obtenido por purificación del veneno y una muestra del Css54 sintético purificado por HPLC. El tiempo de elución de ambos péptidos Css54 nativo y sintético coincide (Figura 4), la secuencia de aminoácidos del péptido sintético es idéntica a la del nativo por lo que concluimos que la síntesis del Css54 (SEQ ID NO: 1) fue exitosa.

Ejemplo 3. Ensayos de inhibición de crecimiento bacteriano en fase sólida El Clinical Laboratory Standars Institute (CLSI), antes conoci-do como (National Committee for Clinical Laboratory Stan-dards) (NCCLS), así con la World Health Organization (WHO), recomiendan el empleo de cultivos frescos para la realización de ensayos de susceptibilidad antimicrobiana a antibióticos. Estos cultivos deben cumplir con una densidad celular de 1 x 108 UFC/ml en fase de crecimiento exponencial. Para determinar la actividad antimicrobiana del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) se realizaron ensayos de susceptibilidad antimicrobiana mediante la metodología de difusión radial en placa, la cual consiste en medición de la inhibición del crecimiento bacteriano generada por un agente antimicrobiano. Para ejemplificar en la presente invención se realización los ensayos utilizando 7 ce- pas de microorganismos diferentes, 4 son Gram-positivas, 2 son Gram-negativas y una levadura, los microorganismos fueron cultivados utilizando como medio de cultivo caldo nutritivo Mueller-Hinton (Bioxon) a una temperatura de 37 °C durante un periodo de 18-24 horas, de acuerdo a las recomendaciones del CLSI. Estos microorganismos son de interés clínico ya que se encuentran en diversas infecciones tópicas como Pie Diabético como lo reportan Bravo-Maceda et. al., 2009 [31]. Además microorganismos como S. aureus son los que generalmente pre-sentan resitencia a antibióticos comerciales [5]. Posteriormente los cultivos fueron ajustados a una Densidad Óptica (DO) de 0.2 a 625 nm (-1.5 x 108 U.F.C/ml). Se adicionó 1 mi de cada cultivo a tubos de ensayo con 9 mL de medio de cultivo sólido fresco, fundido y estéril, los cuales fueron vaciados en cajas de Petri, después de que el medio de cultivo solidificó se agregaron 5 µ? de las respectivas soluciones del péptido antimicrobiano a concentraciones seriadas de 300, 150, 75, 37, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0.15 µ?. Los diferentes cultivos bacterianos se incubaron por espacio de 18-24 h y finalmente se observó la presencia o ausencia de crecimiento bacteriano. La concentración mínima inhibitoria se estableció como la concentración mínima del péptido antimicrobiano en la cual no se observa crecimiento bacteriano en la respectiva placa (Figura 5).

Ejemplo 4. Ensayos de lisis de eritrocitos Para verificar el posible efecto lítico del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) se observó la actividad hemolítica del péptido y fue comparada con diferentes péptidos de acción similar. La actividad hemolítica fue determinada mediante la incubación de suspensiones celulares de glóbulos rojos humanos con diluciones seriales de los péptidos a concentraciones desde 25 µ? hasta 1 µ?. Los glóbulos rojos fueron lavados intensivamente con una solución amortiguadora de fosfatos (10 mM, pH 7.1) y posteriormente fueron centrifugados por espacio de 3 minutos a 900 g de aceleración, entre cada lavado, hasta que la absor-bancia del sobrenadante igualó a la de la solución de lavado. La concentración de glóbulos rojos presentes en la solución se determinó mediante conteo directo en un hematocitómetro y ajustada a aproximadamente 7.7 x 106 células por mililitro. Se incubaron 195 pL de esta suspensión en microplacas de ensa-yo de 96 pozos con 5 µ? del péptido Css54 a diferentes concentraciones. Los glóbulos rojos fueron incubados a temperatura ambiente por espacio de una hora en presencia de 10% de Tritón X100 y agua tretradestilada (controles positivos), PBS (10 mM, pH 7.1) (control negativo) y las soluciones con dife-rentes concentraciones del péptido. Posteriormente las muestras fueron centrifugadas y se determinó la absorbancia del sobrenadante a 570 nm. Después de incubar por 1 hora a 37 °C, se centrifugó la muestra a 900 g por 2 minutos y se leyó la absorbancia de 100 pL del sobrenadante a 540 nm, en un es-pectrofotómetro Beckman DU-50. Finalmente se determinó el porcentaje de hemolisis de los glóbulos rojos, tomando como 100% el valor de DO a 570 nm observado en los controles positivos. El péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) a concentraciones en torno de 10 micromolar puede causar 20% de lisis a glóbulos rojos humanos (Figura 6).

Ejemplo 5. Ensayos de inhibición de crecimiento bacteriano del péptido Css54 en fase líquida, en combinación con antibióticos convencionales.

Similarmente para que los cultivos en fase líquida cumplieran con una densidad celular de 1 x 108 UFC/ml en fase de crecí- miento exponencial, y con la finalidad de establecer las condiciones y tiempo de cultivo a las cuales las diferentes cepas bacterianas cumplieran con los requerimientos anteriores, se realizó el seguimiento de sus respectivas cinéticas de creci-miento. En tubos de ensayo conteniendo un volumen de 4.5 mi de caldo de cultivo Mueller-Hinton fueron inoculadas colonias aisladas en cultivo sólido (18 h de incubación a 37 °C) de las diferentes cepas ensayadas, posteriormente el seguimiento del crecimiento bacteriano se llevó a cabo mediante la medición del incremento en la densidad óptica de los cultivos a una longitud de onda de 625 nm (Espectrofotómetro Molecular Devices, Spectramax plus 384) y el conteo directo de colonias por el ensayo de diluciones seriales (18 h de incubación a 37 °C) en intervalos de 2 horas entre mediciones. Con el fin de mos-trar el potencial de la actividad antibiótica del péptido Css54 (SEQ ID NO: 1 ) en composiciones que comprenden adicional-mente diferentes antibióticos convencionales como kanamicina, estreptomicina, isoniazida, pirazinamida y rifampicina, los cuales son de uso común en infecciones por microorganismos Gram negativos y Gram positivos, se realizaron pruebas de inhibición del crecimiento de diferentes bacterias. Los ensayos se realizaron incubando 5 microlitros (µ?_) de cada muestra de las diferentes composiciones con mezclas del péptido Css54 y algún antibiótico convencional, a ser ensayada, resuspendida en 0.01 % de ácido acético y 0.2% de albúmina sérica bovina (BSA) a diferentes concentraciones en microplacas de ensayo de 96 pozos con 95 pL de un cultivo conteniendo aproximadamente 1x108 bacterias por mililitro (mi). El crecimiento microbiano se monitoreó por medición de densidad óptica a 625 nm, en un lector de ELISA modelo 2550, después de incubar por 18 horas a 37 °C. Como control positivo se usó albúmina bovina (BSA) 0.2% con 0.1% de ácido acético, y como control negativo formaldehido al 0.4%. A fin de ejemplificar la conveniencia de la elaboración de composiciones farmacéuticas del nuevo péptido antibiótico Css54 con antibióticos convencionales, en la figura 9 A) y 9 B) se muestra el efecto del péptido Css54 y la combinación del péptido Css54 con Pirazinamida sobre la bacteria de importancia clínica Staphylococcus aureus. En la figura 10 C) se muestra el efecto del péptido Css54 y la combinación del péptido Css54 con Isoniazida. En la figura 10 D) se muestra el efecto del péptido Css54 y la combinación del péptido Css54 con Rifampicina. En la figura 11 E) se muestra el efecto del péptido Css54 y la combinación del péptido Css54 con Estreptomicina. En la figura 11 F) se muestra el efecto del péptido Css54 y la combinación del péptido Css54 con Kanami-ciña. Así mismo la figura 12 se muestran los resultados de la aplicación de composiciones del péptido Css54 con antibióticos de uso común contra Staphylococcus aureus, pudiéndose observar que mayoritariamente se presenta un efecto Sinérgi-co.

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Claims (17)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S Un péptido aislado y purificado con actividad antibiótica caracterizado por presentar una secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1, o cualquier modificación o mutación conservativa f uncionalmente equivalente de la misma. Un péptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado por: a) Presentar un peso molecular teórico de 2,870.4 Dalto- nes por espectrometría de masas; b) Presentar un punto isoeléctrico calculado de 10.4; c) Presentar una secuencia aminoacídica libre de residuos de cisteína, y d) Presentar una estructura alfa-helicoidal en su estructura secundaria. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado por inhibir el crecimiento de microorganismos seleccionados del grupo que consiste de: bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas y levaduras. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado por que las bacterias Gram positivas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de los géneros: Enterococcus , Bacillus y Staphylococcus. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado por que las bacterias Gram positivas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consis- te de: Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Staphylococ- cus aureus, Staphylococcus epidermis. 6. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado por que las bacterias Gram negativas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de los géneros: Pseudomon as y Escherichia. 7. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado por que las bacterias Gram negativas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de: Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. 8. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado por que la levadura cuyo crecimiento inhibe es del género Candida. 9. Un péptido antibiótico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado por que la levadura cuyo crecimiento inhibe es Candida albicans. 10. Una composición farmacéutica antibiótica caracterizada porque comprende un péptido de conformidad con la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente acepta- ble y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 11. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque los microorganismos cuyo crecimiento inhibe son seleccionados del grupo que consiste de: bacterias Gram positivas, bacterias Gram negativas y levaduras. 12. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque las bacterias Gram positivas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de los géneros: Enterococcus, Bacillus y Staphylococcus . 13. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque las bacterias Gram positivas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de: Enterococcus faecalis, Bacillus sub- tilis, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermis. 14. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque las bacterias Gram negativas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de los géneros: Pseudomonas y Esche- richia. 15 Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque las bacterias Gram negativas cuyo crecimiento inhibe son seleccionadas del grupo que consiste de: Pseudomonas aeruginosa y Esche- richia coli. 16. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la levadura cuyo crecimiento inhibe es del género Candida. 17 Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la levadura cuyo crecimiento inhibe es Candida albicans. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende adicio-nalmente un segundo antibiótico seleccionado del grupo que consiste de: Estreptomicina, Kanamicina, Rifampicina, Iso-niazida y Pirazinamida. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, caracterizada porque presenta un efecto sinérgico respecto de la composición de la reivindicación 10, en la inhibición del crecimiento de microorganismos. Un segmento de ADN que codifica para el péptido antibiótico de la reivindicación 1, caracterizado por presentar una secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 2. R E S U M E N La presente invención se refiere a un péptido denominado Css54 (SEQ ID NO: 1), con actividad antibiótica contra un cier-to grupo de microorganismos, conteniendo 25 aminoácidos y con un peso molecular de 2,870.4 Daltones, que fue aislado y purificado a partir del veneno del alacrán Centruroides suffu-sus suffusus. Dicho péptido también puede ser obtenido por otros medios como síntesis química, o bien mediante la técnica del ADN recombinante. El péptido Css54 (SEQ ID NO: 1) es de estructura secundaria alfa-lineal, la cual difiere de la estructura de otros péptidos, como los que presentan un estructura de hojas betas con puentes disulfuro, como del grupo de las beta-defensinas. La presente invención también se refiere a compo-siciones farmacéuticas obtenidas que comprenden dicho péptido y opcionalmente en combinación con antibióticos comerciales como la Kanamicina, Estreptomicina, Isoniazida, Pirazi-namida o la Rifampicina.