MX2008012991A - Anticuerpos que ligan proteina tirosina fosfatasa humana beta (hptpbeta) y los usos de estos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos y sus fragmentos aglutinantes de antígenos que ligan la proteína tirosina fosfatasa humana beta (HPTPß), y sus usos.

Description

ANTICUERPOS QUE LIGAN PROTEINA TIROSINA FOSFATASA HUMANA BETA (HPTPBETA) Y LOS USOS DE ESTOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con anticuerpos y fragmentos aglutinantes de antígeno de éstos que se unen con la proteína humana tirosina fosfatasa beta (????ß) y el uso de éstos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La angiogénesis, la proliferación de nuevos vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente, juega un papel importante en una amplia variedad de procesos fisiológicos y patológicos (Nguyen, L.L. y col., Int. Rev. Cytol., 204, 1-48, (2001)). La angiogénesis es un proceso complejo, arbitrado por la comunicación entre las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y el entorno que los rodea. En las primeras etapas de la angiogénesis, el tejido o las células del tumor producen y segregan factores de crecimiento pro-angiogénicos en respuesta a los estímulos ambientales tales como la hipoxia. Estos factores se propagan hacia las células endoteliales cercanas y estimulan los receptores que llevan a la producción y secreción de proteasa que degenera la matriz extracelular circundante. Las células endoteliales activadas comienzan a migrar y proliferar en el tejido circundante hacia la fuente de estos factores de crecimiento (Bussolino, F., Trends Biochem. Sci., 22, 251-256, (1997)). Las células endoteliales, luego, dejan de proliferar y se diferencian en estructuras tubulares, lo cual significa el primer paso en la formación de vasos sanguíneos maduros y estables. Posteriormente, las células periendoteliales, tales como los pericitos y las células tersas musculares, se unen a un vaso recientemente formado en un paso adicional hacia la maduración del vaso. La angiogénesis se regula a través de un equilibrio de factores pro y antiangiogénicos que ocurre naturalmente. El factor de crecimiento endotelial vascular, el factor de crecimiento fibroblástico y la angiopoietina representan algunos de los muchos factores de crecimiento pro-angiogénicos potenciales. Estos ligandos se unen a sus respectivas tirosinas quinasas receptoras en la superficie de las células endoteliales y señales transductoras que promueven la migración y la proliferación celular. Mientras que algunos factores regulatorios han sido identificados, los mecanismos moleculares que impulsan este proceso no han sido completamente comprendidos aún. Hay muchos estados de trastornos impulsados por angiogénesis persistentemente regulada de forma indebida o no regulada. En esos estados de trastorno, la angiogénesis persistentemente regulada de forma indebida o no regulada puede causar una enfermedad particular o agudizar una condición patológica existente. Por ejemplo, la neovascularización ocular ha sido implicada como la causa más común de ceguera y es la base de la patología de aproximadamente 20 trastornos de la vista. En ciertas condiciones existentes previamente, tales como la artritis, los vasos sanguíneos capilares recientemente formados invaden las uniones y destruyen el cartílago. En la diabetes, los nuevos capilares formados en la retina invaden el humor vitreo, provocando hemorragias y ceguera. Tanto el crecimiento como la metástasis de los tumores sólidos también pueden depender de la angiogénesis, Folkman y col., "Tumor Angiogenesis" (Angiogénesis tumoral), capítulo 10, 206-32, en The Molecular Basis of Cáncer (La base molecular del cáncer), Mendelsohn y col., eds., W. B. Saunders, (1995). Se ha demostrado que esos tumores que aumentan a más de 2 mm de diámetro deben obtener su propio suministro de sangre y por lo tanto inducen el crecimiento de los vasos sanguíneos capilares nuevos. Después que estos nuevos vasos sanguíneos se incrustan en el tumor, proporcionan nutrientes y factores de crecimiento esenciales para el crecimiento del tumor así como un medio para que las células del tumor ingresen en la circulación y hagan metástasis en sitios distantes, tales como el hígado, pulmón o hueso (Weidner, New Eng. J. Med., 324, 1 , 1-8 (1991)). Cuando se usan fármacos en los animales que tienen tumores, los inhibidores naturales de la angiogénesis pueden evitar el crecimiento de pequeños tumores (O'Reilly y col., Cell (Célula), 79, 315-28 (1994)). En algunos protocolos, la aplicación de esos inhibidores lleva a la regresión y al letargo del tumor aún después de la cesación del tratamiento (O'Reilly y col., Cell (Célula), 88, 277-85 (1997)). Además, la provisión de inhibidores de la angiogénesis para ciertos tumores puede potenciar la respuesta a otros regímenes terapéuticos (ver, p. ej., Teischer y col., Int. J. Cáncer (Cáncer), 57, 920-25 (1994)).

A pesar de que muchos estados de trastornos son impulsados por la angiogénesis persistentemente regulada de forma indebida o no regulada, algunos estados de trastornos pueden tratarse acentuando la angiogénesis. El crecimiento y la reparación del tejido son casos biológicos caracterizados además porque se produce la proliferación celular y la angiogénesis. En consecuencia, un aspecto importante de la reparación de heridas es la revascularización del tejido dañado por la angiogénesis. Las heridas crónicas, no sanadas, son una causa principal de la continua mortalidad en la población humana anciana. Este sucede, específicamente, en pacientes postrados en la cama o pacientes diabéticos que desarrollan úlceras severas de la piel que no se sanan. En muchos otros casos, la demora en la curación es el resultado de un suministro de sangre inadecuado ya sea como resultado de la presión continua o del bloqueo vascular. La circulación capilar escasa debido a una aterosclerosis arterial menor o estasis venosa contribuye a la falta de reparación del tejido dañado. Esos tejidos a menudo se infectan con microorganismos que proliferan sin ser desafiados por los sistemas de defensa innatos del cuerpo que requieren un tejido bien vascularizado para eliminar de forma efectiva los organismos patogénicos. Como resultado, la mayoría de las intervenciones terapéuticas se centran en la restauración del flujo sanguíneo de tejidos isquémicos permitiendo así que los nutrientes y los factores inmunológicos accedan al lugar de la herida. Las lesiones ateroscleróticas en los grandes vasos pueden provocar isquemia en el tejido que puede mejorarse modulando el crecimiento del vaso sanguíneo en el tejido afectado. Por ejemplo, las lesiones ateroscleróticas en las arterias coronarias pueden provocar angina e infartos de miocardio que podrían evitarse si se pudiera restituir el flujo sanguíneo estimulando el crecimiento de las arterias colaterales. De forma similar, las lesiones ateroscleróticas en las grandes arterias que abastecen a las piernas pueden provocar isquemia en el músculo del esqueleto, lo que limita la movilidad y, en algunos casos, requiere la amputación, lo cual también puede evitarse mejorando el flujo sanguíneo con terapia angiogénica. Otros trastornos, tales como la diabetes y la hipertensión se caracterizan por una disminución en el número y en la densidad de los vasos sanguíneos pequeños tales como las arteriolas y los capilares. Estos vasos sanguíneos pequeños son importantes para el suministro de oxígeno y nutrientes. Una disminución en el número y en la densidad de estos vasos contribuye a las consecuencias adversas de la hipertensión y la diabetes incluyendo la claudicación, úlceras isquémicas, hipertensión acelerada, y problemas renales. Estos desórdenes comunes y muchas otras afecciones menos comunes, tales como el trastorno de Burgers, podrían mejorarse aumentando el número y la densidad de los vasos sanguíneos pequeños usando la terapia angiogénica. Así, existe una necesidad continua de identificar reguladores de la angiogénesis. En virtud de lo mencionado anteriormente, existe una necesidad de identificar objetivos bioquímicos en el tratamiento de la angiogénesis mediada por desórdenes. No obstante, la angiogénesis implica la acción de múltiples factores de crecimiento y sus tirosinas quinasas del receptor consanguíneo (RTKs), Yancopoulos y col., Nature, 407,242-248, 20O0). El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), por ejemplo, es importante para la diferenciación de las células endoteliales en vasos sanguíneos nacientes en la vasculatura embrionaria. Además, el VEGF aumenta el desarrollo de vasos sanguíneos en la vasculatura adulta. La administración del VEGF exógeno aumenta el desarrollo de la vasculatura colateral y mejora el flujo sanguíneo de los tejidos isquémicos. Hasta este momento, han sido identificados tres VEGF RTKs, VEGFR1 (FLT-1), VEGFR2 (KDR), y VEGFR3 (FLT-4). Aunque estos receptores son altamente conservados, basados en la caracterización bioquímica y en la actividad biológica, cada receptor tiene funciones específicas y que no se superponen. De los tres receptores, se cree que el VEGFR2 juega un papel predominante en la mediación de las acciones del VEGF en el desarrollo de la vasculatura y durante la angiogénesis en adultos. No obstante, se requieren ambos receptores VEGFR1 y VEGFR3 para el desarrollo normal de la vasculatura embrióníca y puede ser además importante para la angiogénesis en los tejidos adultos. Sobre la unión y dimerización del receptor VEGF, un cambio conformacional en el dominio de la quínasa VEGFR2 aumenta la actividad de la quinasa resultante en la "autofosforilacíón" del otro miembro del par en residuos específicos de tirosína. Los casos de autofosforilacíón sirven, además, para aumentar la actividad de la quinasa y proveer puntos de sujeción para la asociación de las moléculas de señalización intracelulares. No obstante, la activación de una ruta angiogénica sencilla puede no ser suficiente para producir vasos persistentes y funcionales que provean perfusión adecuada a los tejidos isquémicos. Estas conclusiones, junto con aquellas RTKs múltiples, están implicadas en el ensamble del montaje de la vasculatura embriónica, indican que los blancos bioquímicos que modulan las rutas angiogénicas múltiples tienen ventajas sobre la administración de un factor de crecimiento simple. Las proteínas tirosinas fosfatasas (PTP, por sus siglas en inglés) comprenden una gran familia de enzimas estrechamente relacionadas que desfosforilan las proteínas que contienen residuos de fosfotirosina. Evidencia reciente sugiere que una función de las PTP es limitar las fosforilación y la activación de los RTK. Por ejemplo, se mostró la HCPTPA, una proteína tirosina fosfatasa de bajo peso molecular para asociarse con VEGFR2 y regular negativamente su activación en células endoteliales cultivadas y su actividad biológica en los ensayos de angiogénesis, (Huang y col., Journal of Biological Chemistry (Gaceta de Química Biológica), 274, 38183-38185, 1999). Además de VEGFR2, el ingreso de señalización desde otro RTK, Tie-2, el receptor para las angiopoietinas (Ang1 y Ang2), también es importante. La supresión de Ang1 o del gen Tie-2 en los ratones puede dar como resultado una letalidad embriónica secundaria a las anormalidades en la vasculatura de desarrollo (Yancopoulos y col., Nature, 407, 242-248, 2000). Además la sobre- expresión del receptor Ang1 en la piel aumenta la vascularidad de la misma y la administración exogena del Ang1 aumenta la circulación sanguínea del músculo del esqueleto isquémico (Suri y col., Science, 282, 468-471 , 1998). Además, al inhibir la activación de Tie-2 se inhibe la angiogénesis y se limita la progresión del tumor en los modelos animales de cáncer, (Lin y col., J Clin. Invest., 100, 2072-2078, 1997). Además de las actividades angiogénicas, la activación de Tie-2 mediante la administración exogena del Ang1 bloquea la fuga vascular mediada por VEGF y los efectos pro-inflamatorios, pero aumenta sus efectos angiogénicos (Thurston y col., Nature Medicine, 6, 460-463, 2000). Por ello, los blancos biológicos que modulan la señalización de VEGFR2 y de Tie-2 pueden producir terapias proangiogénicas o angiogénicas. HPTPbeta (primero descrito en Kruegar y col., EMBO J., 9, (1990)) ha sido sugerido para modular la actividad del Tie-2 quinasa tirosina del tipo receptor de angiopoietina, por ejemplo, en WO 00/65088). HPTPbeta también se sugiere para regular las actividades del VEGFR2, por ejemplo, en la patente publicada de los EE.UU. núm. 2004/0077065. Seria deseable desarrollar anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humanizado, el cual regula de forma selectiva la actividad de HPTPbeta y de ese modo aumenta la señalización angiogénica, estimula el crecimiento del vaso sanguíneo (angiogénesis), y/o aumenta la circulación sanguínea en los tejidos isquémicos, o reduce la señalización angiogénica, reduce el crecimiento del vaso sanguíneo, y/o disminuye la circulación sanguínea del tejido operado. Por medio de este documento se describen anticuerpos y fragmentos que ligan HPTPbeta y regulan la señalización de células angiogénicas que, a su vez, regulan la angiogénesis.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con anticuerpos que ligan proteína humana tirosina fosfatasa beta HPTPbeta y por ello regulan la señalización de células angiogénicas que, a su vez, regulan la angiogénesis. En una modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo aislado o un fragmento aglutinante de antígeno de éstos que se une a la proteína humana tirosina fosfatasa beta, en donde el anticuerpo o el fragmento aglutinante de antígeno de éstos regula la señalización de células angiogénicas que, a su vez, regulan la angiogénesis. En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo que liga la porción N-terminal de la proteína humana tirosina fosfatasa beta. En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo que liga la primera repetición FN3 de la proteína humana tirosina fosfatasa beta. En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo que liga la primera repetición FN3 de la proteína humana tirosina fosfatasa beta, en donde la primera repetición FN3 de la proteína humana tirosina fosfatasa beta tiene la secuencia como se indica en sec. con núm. de ident. 11 , o una porción de ésta.

En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal R15E6 (Mouse hybridoma (Hibridoma de ratón), Balbc spieen cells (B cells) Célula de bazo Balbc (Células B) depositado con American Type Culture Collection (Colección Americana de Tipos de Cultivos) (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA el 4 de mayo de 2006, asignada ATCC núm. PTA-7580). En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo que tiene las mismas, o sustancialmente las mismas características biológicas que R15E6. En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo, en donde el anticuerpo o el fragmento aglutinante de antígenos se humanizan. En otra modalidad, la invención se relaciona con un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende residuos de la región aglutinante de antígenos desde el anticuerpo monoclonal R15E6 y se humaniza. En otra modalidad, la invención se relaciona con un fragmento aglutinante de antígenos de un anticuerpo, en donde el fragmento comprende regiones variables de cadena pesada y liviana. En otra modalidad, la invención se relaciona con un fragmento aglutinante de antígenos de un anticuerpo, en donde el fragmento aglutinante de antígenos se selecciona del grupo que comprende un fragmento Fv, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.

En otra modalidad, la invención se relaciona con un método de tratamiento del trastorno regulado por angiogénesis en un individ uo; el método comprende: identificar un individuo que requiere regulación de la angiogénesis; y la administración al individuo de una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento aglutinante de antígeno de éste, el cual liga el HPTPbeta y regula la angiogénesis. En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno regulado por angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno elevado por la angiogénesis y se selecciona del grupo que comprende rinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, anemia falciforme, sarcoma, sífilis, pseudoxanthoma elasticum, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, inflamación crónica de la úvea/vitritis, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematosis sistémico, retinopatia de la prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones que provocan retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de la retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, trauma y complicaciones post-láser, enfermedades asociadas con la rubeosis, y vitreoretinopatía proliferativa. En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno regulado por angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno elevado por la angiogénesis, y se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, inopatía diabética, degeneración macular, cáncer, artritis reumatoidea, hemangiomas, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, o telangiectasia hemorrágica hereditaria, y tumores de transmisión sanguínea o sólidos En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno regulado por angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno elevado por la angiogénesis, y se selecciona del grupo que comprende enfermedades de inflamación intestinal tales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, psoriasis, sarcoidosis, artritis reumatoidea, hemangiomas, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, o telangiectasia hemorrágica hereditaria, y tumores de transmisión sanguínea o sólidos y síndrome de inmunodeficiencia adquirida. En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno regulado por angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno reducido de la angiogénesis y se selecciona del grupo que incluye, pero no se limita a, el músculo del esqueleto o isquemia del miocardio, ataque al corazón, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad vascular periférica, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad cerebrovascular, neuropatía diabética y cicatrización de heridas. En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno regulado por angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno regulado por la angiogénesis es un trastorno reducido de la angiogénesis y se selecciona del grupo que comprende el músculo del esqueleto o isquemia del miocardio, ataque al corazón, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad vascular periférica, enfermedad de la arteria coronaria. En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno reducido de la angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno reducido de la angiogénesis es una enfermedad vascular periférica. En otra modalidad, la invención se relaciona con un método para tratar el trastorno reducido de la angiogénesis en un individuo, en donde el trastorno reducido de la angiogénesis es una enfermedad de la arteria coronaria. En otra modalidad, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento de ello que liga la proteína humana tirosina fosfatasa beta; un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento de ello que liga la proteína humana tirosina fosfatasa beta, en donde el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal R15E6; y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende: un anticuerpo o un fragmento de éste que liga la proteína humana tirosina fosfatasa beta, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene las mismas, o prácticamente las mismas características biológicas del R15E6; y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra modalidad, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende: un anticuerpo o un fragmento de ello que liga la proteína humana tirosina fosfatasa beta, en donde el anticuerpo o el fragmento aglutinante de antígenos se humaniza; y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento de ello que liga la proteína humana tirosina fosfatasa beta, en donde el anticuerpo comprende residuos de regiones aglutinantes de antígeno del anticuerpo monoclonal R15E6 y se humaniza; y un portador farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A y 1 B. Diseño y producción de la proteína ????ß ECD. (Figura A) Representación esquemática de toda la proteína extracelular de fusión de dominio 6His ????ß y ????ß. (Figura B) Mancha plateada de eluato imidazol de una columna Ni-NTA cargada con sobrenadante de células HEK293 transfectadas con un vector que dirige la expresión de ßECD-6His. Se detecta una banda simple de alto peso molecular consistente con proteína de dominio 6His ????ß extracelular. Figuras 2A y 2B. R15E6 reconoce ????ß endógeno en células endoteliales. (Figura A) Los lisatos de células endoteliales son inmunoprecipitados con una anticuerpo de control (Pasaje 1), con R15E6 (Pasaje 2) o con una mezcla de anticuerpos anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (Pasaje 3). Los inmunoprecipitados se resuelven mediante SDS-PAGE, transferidos a una membrana PVD y probados por inmunoensayo western blot con una mezcla de R15E6, anticuerpos anti-Tie2 y anti-VEGFR2. Una banda simple de mayor peso molecular consistente con ????ß se ve con R15E6 (Pasaje 2) y no con el anticuerpo de control (Pasaje 1) o la mezcla de anticuerpos anti-Tie2 y anti-VEGFR2 (Pasaje 3). (Figura B) Las células endoteliales están sujetas al análisis FACS con R15E6 (punta blanca) o a un control de anticuerpo primario (punta negra). El cambio contundente en la fluorescencia indica que R15E6 liga con ????ß sobre la superficie de las células endoteliales intactas. Figura 3. R15E6 aumenta la activación del Receptor Tie2 en los HUVECs. La activación del Tie2 se mide en las células endoteliales humanas como se describe en el Ejemplo 4. La dosificación de R15E6 de forma dependiente aumenta tanto la activación básica y el receptor Tie2 inducido por Ang1. Figuras 4A-4D. R15E6 aumenta la subsistencia de HUVEC. Se mide la subsistencia de las células endoteliales humanas privadas de suero como se describe en el Ejemplo 4. Consistente con sus efectos en la activación Tie2, la dosificación R15E6 de forma dependiente aumenta tanto la activación básica y el receptor Tie2 inducido por la subsistencia de las células endoteliales inducidas Angls (Figura A). Además, la dosificación de R15E6 de forma dependiente aumenta la subsistencia de las células endoteliales mediadas por VEGF y FGF (Figuras B y C). Un anticuerpo de control no puede aumentar la subsistencia de la célula endotelial (Figura D). Figura 5. R15E6 aumenta la migración de HUVEC. La migración de las células endoteliales humanas se miden como se describe en el Ejemplo 4. La dosificación de R15E6 de forma dependiente aumenta tanto la migración base como la de la célula endotelial inducida por VEGF. Figura 6. R15E6 aumenta la morfogénesis capilar en el ensayo de proliferación en el glóbulo/HUVEC. La morfogénesis capilar de células endoteliales humanas se mide en el ensayo de proliferación en el glóbulo como se describe en el Ejemplo 4. R15E6 aumenta tanto la morfogénesis capilar basal como la celular endotelial inducida por VEGF. Figuras 7A y 7B. El análisis por Western blot localiza el epítopo de unión R15E6 en la repetición N-terminal FN3 del dominio extracelular ß del HPTP. (Figura A) Mediante el análisis por western, R15E6 liga todos los muíante de truncación C-terminal que demuestran que el epítopo de unión se ubica en las repeticiones N-terminal 2 FN. (Figura B) El análisis de las proteínas quimeras humanas/de ratón además localizan el epítopo de unión R15E6 en la repetición ß N-terminal FN3 HPTP. Figuras 8A y 8B. El análisis MSD confirma la localización del epítopo de unión R15E6 en la repetición N-terminal FN3 del dominio extracelular ????ß. (Figura A) Mediante el análisis MSD, R15E6 liga a todos los mutantes de truncación C-terminal confirmando que el epítopo de unión se ubica en las repeticiones N-terminal 2 FN3. (Figura B) el análisis de las proteínas quimeras humanas/de ratón además confirman la localización del epítopo de unión R15E6 en la repetición del N-terminal FN3 ????ß. Figuras 9A y 9B. El análisis MSD demuestra que el fragmento Fab R15E6 monovalente también liga la repetición N-terminal FN3 del ????ß. (Figura A) Similar al anticuerpo intacto R15 E6, el fragmento Fab R15E6 se liga a todos los mutantes de truncación C-terminal confirmando que el epítopo de unión se ubica en las repeticiones N-termínal 2 FN3. (Figura B) El análisis de las proteínas quimeras humanas/de ratón además localizan el epítopo de unión del fragmento Fab R15E6 en la repetición N-terminal FN3 ????ß. Figura 10. El fragmento Fab R15E6 monovalente no puede aumentar la activación Tie2 y bloquea la activación Tie2 mediante el R15E6 intacto. Figuras 11A y 11 B. El fragmento Fab R15E6 inhibe potencialmente la subsistencia de las células endoteliales. (Figura A) Comparado con un fragmento Fab de control, el fragmento Fab R15E6 inhibe potencialmente la subsistencia de las células endoteliales. (Figura B) El efecto inhibitorio del fragmento Fab R15E6 se rescata mediante la competición con el R15E6 intacto. Figura 12. El fragmento Fab R15E6 inhibe la migración de las células endoteliales mediadas por VEGF.

DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS Cada secuencia de nucleótido y proteína en la lista de secuencias, junto con el(los) correspondiente(s) número(s) de acceso Genbank o Derwent, si fuese aplicable, y las especies desde donde deriven, se indican en el Cuadro I.

Cuadro l Descripción de secuencias Sec. con núm. de Especie Acceso ident.: Nucleótido, equivalente Proteína Genbank Núm.

Dominio extracelular de 1 , 2 Homo Sapiens HPTPbeta con His y Gly tag Dominio extracelular de 3 Homo Sapiens X54131 HPTPbeta de total longitud NM_002837 1/2 (AA1 -730, 8 FN3's)775 aa 4 Homo Sapiens 1/4 (AA1-376, 4 FN3's)421 aa 5 Homo Sapiens 1/8 (AA1 -202, 2 FN3's)247 aa 6 Homo Sapiens ECD1632 aa de ratón de 7 Mus musculus NM_029928 longitud total Primer humano FN3-ratón V-¡ 8 Quimera ratón-humano FN3-Mouse ½ segundo 9 Quimera ratón-humano humano Primeros dos humanos FN3, - 10 Quimera ratón-humano ratón ½ FN3 humano, primera 1 1 Homo sapiens repetición DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con anticuerpos que ligan HPTPbeta y el uso de éstos. Las técnicas estándares pueden usarse para el DNA recombinante, la síntesis oligonucleótida, y el cultivo y transformación de tejidos (p. ej. , electroporación, electroporación). Las reacciones enzimáticas y las técnica de purificación pueden llevarse a cabo de conformidad con las especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la industria o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos se realizan, generalmente, de conformidad con los métodos convencionales conocidos en la industria y como se describe en las diferentes referencias generales y más específicas que se mencionan y discuten a lo largo de la especificación de la presente. A menos que se provean especificaciones en contrario, la nomenclatura utilizada en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química farmacéutica y medicinal descrita en la presente son aquellas conocidas y comúnmente usadas en la industria. Las técnicas estándares pueden usarse para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y entrega, y tratamiento de pacientes. Los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderán como que poseen los siguientes significados: "Proteina", se usa en la presente de forma intercambiable con péptido y polipéptido. HPTPbeta es proteína humana tirosina fosfatasa como se define en la lista de secuencia. En algunas de las modalidades, se usan varios fragmentos de HPTPbeta. Homólogos, ortólogos, fragmentos, variantes, y mutantes de la proteína HPTPbeta y del gen, como se describen debajo, se consideran como dentro del alcance del término "HPTPbeta". Por "fragmento" se intenta definir una porción de la secuencia de nucleótidos o proteínas. Los fragmentos pueden retener la actividad biológica de la proteína nativa. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos también son útiles como sondas de hibridización e imprimadores o para regular la expresión de un gen, por ejemplo, antisentido, siRNA, o micro RNA. Una porción activa biológicamente puede prepararse por aislamiento de una porción de una de las secuencias de nucleótidos de la invención, expresando la porción codificada (p. ej., por expresión recombinante in vitro), y evaluando la actividad de la proteína codificada. Una persona con experiencia en la industria también reconocerá que pueden ser útiles los genes y proteínas de las especies que no son aquellas enumeradas en la lista de secuencias, particularmente especies vertebradas. Esas especies incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas, conejillos de india, conejos, perros, cerdos, cabras, vacas, monos, chimpancés, ovejas, hámsters y peces cebra. Aquellos con conocimiento en la industria reconocerán, adicionalmente, que al utilizar sondas de las secuencias de las especies conocidas, el ADNc o las secuencias genómicas homologas de la secuencia conocida podrán obtenerse a partir de la misma especie o de especies alternas por medio de los métodos de clonación conocidos. Esos homólogos y ortólogos se contemplan como útiles al practicar la invención. Por "variantes" se intenta definir secuencias similares. Por ejemplo, las variantes conservadoras pueden incluir aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos de la invención. Las variantes alélicas que se producen naturalmente y las variantes de empalme pueden identificarse usando la técnicas conocidas, por ejemplo, con reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis de polimorfismo de nucleótido simple (SNP), y técnicas de hibridación. Para aislar los ortólogos y homólogos se utilizan, generalmente, condiciones de hibridación rigurosas, dictadas por secuencias específicas, longitud de secuencias, contenido de guanina más citosina (GC), y otros parámetros. Las secuencias de nucleótidos variantes pueden incluir las secuencias de nucleótidos derivados sintéticamente, por ejemplo, derivados usando mutagénesis dirigida en el lugar. Las variantes pueden contener secuencias adicionales del locus genómico solo o en combinación con otras secuencias. Las moléculas de la invención incluyen, además, proteínas truncadas o mutadas en donde las regiones de la proteína no requeridas para el aglutinante del ligando o señalización han sido eliminadas o modificadas. De igual forma, pueden mutar para modificar las actividades del aglutinante del ligando o señalización. Esas mutaciones pueden comprender mutaciones no conservadoras, eliminaciones o agregados de dominios de aminoácidos o proteínas Las proteínas de las variantes pueden retener o no la actividad biológica. Esas variantes pueden dar como resultado, por ejemplo, polimorfismos genéticos o de manipulación humana. Las proteínas de fusión también se contemplan en la presente invención. Utilizando métodos conocidos, una persona con experiencia en la industria podría hacer proteínas de fusión de las proteínas de la invención; de tal manera que, a pesar de estar en forma nativa, pueden ser útiles. Por ejemplo, el asociado de la fusión puede ser una secuencia de señal polipéptida (o conductora) que conduce co-translacionalmente o post-translacionalmente la transferencia de la proteína desde el lugar de la síntesis a otro lugar (p. ej., el conductor del factor a de levadura). Alternativamente, podría agregarse para facilitar la purificación o identificación de la proteína de la invención (p. ej., poly-His, péptido Flag, o proteínas fluorescentes). El término "antígeno" se refiere a una molécula o a una porción de una molécula capaz de ligarse mediante un agente aglutinante selectivo, tal como un anticuerpo, y adicionalmente es capaz de ser usado en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse con un epítopo de aquel antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. El término "epítopo" incluye cualquier determinante antigénico, preferentemente, un determinante polipéptido capaz de ligarse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas modalidades, los determinantes epítopos incluyen agrupaciones de superficie químicamente activa, tales como los aminoácidos, azúcares, lípidos, fosforilo, o sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales específicas de tres dimensiones, o características de carga específica. Un epítopo es una región de un antígeno que se une mediante un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se liga específicamente a un antígeno cuando reconoce, preferentemente, su antígeno meta en una mezcla compleja de proteínas o macromoléculas. Se dice que un anticuerpo se liga específicamente a un antígeno cuando exhibe una mayor afinidad al antígeno que a otras moléculas relacionadas o no relacionadas. El término "anticuerpo" (Ab), como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), anticuerpos de cadena simple, por ejemplo, anticuerpos de llama y camello, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, regiones variables o fragmentos de regiones constantes, con la condición de que exhiban una actividad biológica deseada, por ejemplo, actividad aglutinante de antígeno. El término "¡nmunoglobulina" (Ig) se usa de forma intercambiable con "anticuerpo" en la presente. Un "anticuerpo aislado" es aquel identificado, o separado, o recuperado de su ambiente natural. La unidad básica de anticuerpo de cuatro cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas livianas (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM formado por 5 de la unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y por consiguiente contiene 10 sitios de aglutinantes de antígeno, mientras que los anticuerpos IgA segregados pueden polimerizarse para formar conjuntos polivalentes que comprenden de 2 a 5 de las unidades de 4 cadenas básicas junto con la cadena J). En el caso de los IgGs, la unidad de cuatro cadenas es, generalmente, de aproximadamente 150 kilo Daltons (kDa). Cada cadena L se une a una cadena H mediante una unión de bisulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen una con otra mediante una o más uniones de bisulfuro que dependen del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes de bisulfuro entre cadenas espaciado regularmente. Cada cadena H tiene en la terminal N, un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas a y a y cuatros dominios CH para los isotipos µ y e. Cada cadena L tiene en la terminal N, un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (C|_) en su otro extremo. El VL se alinea con VH y CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. (CH1 ). Se creen que los residuos particulares de aminoácidos forman una interface entre los dominios variables de cadena pesada y de cadena liviana. El apareamiento de VH y VL juntos forma un sitio simple aglutinante de antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology (Inmunología Básica y Clínica), 8° edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, 1994, página 71 y Capítulo 6. La cadena L desde cualquier especie de vertebrados puede asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, con cadenas pesadas designadas a, d, e, ? and µ, respectivamente. Las clases ? y a además se dividen en subclases en base a las diferencias relativamente menores en la secuencia y la función CH, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , y lgA2. Miembros de la familia de los camélidos, por ejemplo, llama, camello y dromedarios, contiene un tipo único de anticuerpo que carece de cadenas livianas y además no posee el dominio CHi (Muyldermans, S. , Rev. Mol. Biotechnol., 74, 277-302 (2001 )). La región variable de estos anticuerpos de cadena pesada se los denomina VHH O VHH, y constituyen el fragmento aglutinante de antígenos intacto disponible más pequeño (15 kDa) derivado de una inmunoglobulina funcional. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio V intercede con el aglutinante de antígenos y define la especificidad de un anticuerpo específico para su antígeno. No obstante, la variabilidad no se distribuye de forma pareja a lo largo del tramo de aminoácidos 1 10 de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en distancias relativamente invariantes denominadas regiones de marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas que la variabilidad extrema denominada "regiones hipervariables" que tienen cada uno un largo de 9 a 12 aminoácidos. Los dominios variables de cada cadena nativa pesada o liviana comprenden cuatro FRs, que adoptan ampliamente una configuración de hoja ß, conectados por tres regiones hipervariables, que forman circuitos que se conectan, y en algunos casos forman parte de, una estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se unen en proximidad de los FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio aglutinante de antígenos de los anticuerpos. Los dominios constantes no se incluyen directamente en la aglutinación de un anticuerpo con un antígeno, pero exhibe varias funciones ejecutadoras, tales como la participación del anticuerpo en una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la aglutinación del antígeno. La región hipervariable comprende, generalmente, residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (p. ej. alrededor de los residuos 24-34 (L1 ), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL, y aproximadamente alrededor de 1 -35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en VH¡ Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de las Proteínas de Interés Inmunológico), 5° Ed. Public Health Service (Servicio Público de Salud), National Institutes of Health (Instituto Nacional de Salud), Bethesda, Md. (1991 )) o aquellos residuos del "circuito hipervariable".

El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para las mutaciones posibles que ocurren naturalmente que pueden estar presente en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal, las cuales incluyen diferentes anticuerpos dirigidos en contra de los epítopos diferentes, cada anticuerpo monoclonal se conduce en contra de un epítopo simple, es decir, un determinante antigénico simple. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen ventajas porque pueden ser sintetizados sin contaminarse por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no se construye como producción necesaria del anticuerpo por cualquier método especifico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden no estar preparados por la metodología de hibridoma o pueden realizarse usando métodos de DNA recombinante en células bacterianas, eucariotas, animales y de plantas (ver, p. ej., patente de los EE.UU. núm. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de las bibliotecas de anticuerpos fagos, usando las técnicas disponibles, por ejemplo, Clackson y col., Nature (Naturaleza), 352:624-628 (1991). Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quimera", en donde una porción de la cadena pesada o liviana es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie específica o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo específico, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es(son) idéntica(s) con u homóloga(s) a las secuencias correspondientes con los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de esos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver patente de los EE.UU núm. 4,816,567; y Morrison y col., Proc. Nati. Acad Sci. EE.UU., 81 , 6851-6855 (1984)). Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo multimérico, preferentemente, el aglutinante de antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, dimeros y trímeros de conjugados Fab, Fv, scFv, minicuerpos; dia-, tria-, tetrabodies; anticuerpos lineales (ver Hudson y col., Nature Med. 9, 129-134 (2003)). "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo el cual contiene un sitio completo de aglutinante de antígeno. Este fragmento consiste de un dimer de un dominio de región variable de una cadena liviana y una cadena pesada en enlace ajustado, no covalente. Del plegamiento de dos dominios surgen seis circuitos hipervariables (3 circuitos cada uno de la cadena H y L) que contribuye con los residuos de aminoácidos para el aglutinante del antígeno y otorga la especificidad del aglutinante del antígeno al anticuerpo. No obstante, aún un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y ligar antígenos, y por ello se incluyen en la definición de Fv.

"Cadena simple Fv" también abreviada como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpos VH y VL conectados con una cadena simple de polipétidos. Preferentemente, el polipéptido sFv además comprende un enlazador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para el aglutinante de antígeno. Los términos "día-, tria-, y tetrabodies" se refieren a los fragmentos pequeños de anticuerpos preparados para construir fragmentos sFv con enlazadores cortos (aproximadamente de 5 a 10 residuos) entre los dominios VH y VL de forma que se logra el apareamiento intercadena y no intercadena de los dominios V, lo que resulta en un fragmento multivalente. El término "anticuerpo humanizado" o "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de regiones variables de cadenas livianas y pesadas de especies no humanas (p. ej., un ratón) pero en las cuales por lo menos una porción de la secuencia VH y/o VL han sido alteradas para ser "más parecido a lo humano", es decir, más parecidas a las secuencias variables en la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado CDR, en el cual se introducen secuencias CDR humanas en las secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias CDR no humanas correspondientes. El medio para realizar anticuerpos humanizados, quimera e injertados CDR son conocidos por aquellas personas con experiencia en la industria (ver, p. ej., patente de los EE.UU. núms. 4,816,567 y 5,225,539). Un método para hacer anticuerpos humanos emplea el uso de animales transgénicos, tales como un ratón transgénico. Estos animales transgénicos contienen una porción sustancial de anticuerpo humano que produce un genoma insertado en su propio genoma y la producción de anticuerpo endógeno es deficiente en la producción de anticuerpos. Los métodos para hacer esos animales transgénicos se conocen en la industria. Esos animales transgénicos pueden hacerse usando tecnología XenoMouseR™ o usando una metodología "minilocus". Los métodos para hacer XenoMiceR™ se describen en la patente de los EE.UU. núms. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598 y 6,075,181. Los métodos para hacer animales transgénicos usando una metodología "minilocus" se describen en la patente de los EE.UU. núms. 5,545,807, 5,545,806 y 5,625,825, y en la WO 93/12227. La humanización de un anticuerpo no humano se ha vuelto una rutina en los últimos años, y ahora se incluye dentro del conocimiento de aquellos con experiencia en la industria. Varias compañías proporcionan servicio para humanizar un anticuerpo, por ejemplo, Xoma, Aries, Medarex, PDL, y Cambridge Antibody Technologies. Los protocolos de humanización se decriben extensamente en la literatura técnica, por ejemplo, Kipriyanov y Le Gall, Molecular Biotechnol (Biotecnología Molecular), Vol. 26, PP 39-60 (2004), Humana Press, Totowa, NJ¡ Lo, Methods Mol. Biol., Vol. 248, pp 135-159 (2004), Humana Press, Totowa, NJ; Wu y col., J. Mol. Biol. 294, 151-162 (1999). En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden expresarse en lineas de células más que en líneas de células hibridoma. Las secuencias que codifican los anticuerpos particulares pueden usarse para la transformación de una célula mamífera huésped adecuada mediante métodos conocidos para la introducción de los polinucleótidos en una célula huésped, lo cual incluye, por ejemplo, el empaque del nucleótido en un virus (o en un vector viral) y transduciendo una célula huésped con el virus (o vector), o mediante los procedimientos de transfección conocidos en la industria, como se ejemplifica en la patente de los EE.UU. núms. 4,399, 216, 4,912,040, 4,740,461 , y 4,959,455. El procedimiento de transformación usado puede depender del huésped a ser transformado. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células mamíferas son conocidos en la industria e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión protoplasto, electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas, ácido nucleico mezclado con lípidos de carga positiva, y microinyección directa de DNA en los núcleos. Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada, una región constante de cadena liviana, o una región variable de cadena liviana de un anticuerpo, o un fragmento de ello en una combinación adecuada si lo desea, es/son insertados en un vector de expresión apropiada usando técnicas de ligación estándares. La región constante de cadena liviana o pesada del anticuerpo puede agregarse al terminal C de la región variable apropiada y se liga al vector de expresión. El vector, por lo general, se selecciona para ser funcional en la célula huésped específica empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de célula huésped de forma que se produzca la amplificación del gen o la expresión del gen). Para una revisión de los vectores de expresión, ver Methods Enzymol. vol. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press. Los anticuerpos y fragmentos de éstos de la presente invención ligan los HPTPbeta y regulan la angiogénesis. Como se definió anteriormente, el término anticuerpo se usa para denotar un fragmento aglutinante de antígenos. Los usos de esos anticuerpos y fragmentos aglutinante de antígenos se describen en detalle más adelante. Ensayos de tamizado usando modelos in vitro e in vivo de la angiogénesis Los anticuerpos de la invención pueden tamizarse en los ensayos de angiogénesis que son conocidos en la industria. Esos ensayos incluyen ensayos in vitro que miden los surrogados del crecimiento del vaso sanguíneo en las células cultivadas o la formación de las estructuras vasculares de los explantes de tejidos y los ensayos in vivo que miden el crecimiento del vaso sanguíneo directa o indirectamente (Auerbach, R., y col. (2003). Clin Chem 49, 32-40, Vailhe, B., y col. (2001). Lab Invest 81 , 439-452). Modelos In vitro de la angiogénesis La mayoría de estos ensayos emplea células endoteliales cultivadas o explantes de tejidos y miden el efecto de los agentes sobre las respuestas de las células "angiogénicas" o sobre la formación de estructuras sanguíneas del tipo capilar. Ejemplos de los ensayos de angiogénses in vitro incluyen, pero no se limitan a, la migración y proliferación de células endoteliales, formación del tubo capilar, proliferación endotelial, el ensayo de explante del anillo aórtico y el ensayo del arco aórtico del pollo. Modelos in vivo de la angioqénesis En estos ensayos los agentes o anticuerpos se administran localmente o sistémicamente en presencia o ausencia de los factores de crecimiento (es decir, VEGF o angiopoietina 1 ) y se mide el crecimiento del nuevo vaso sanguíneo mediante observación directa o midiendo un marcador surrogado tal como el contenido de hemoglobina o un indicador fluorescente. Ejemplos de la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a, un ensayo de la membrana corioalantoica del pollo, el ensayo de la angiogénesis corneal, y el ensayo del enchufe MATRIGEL™. Tratamiento de la angiogénesis regulada por trastornos El término "regula" se define en sus significados aceptados por el diccionario. Asi, el significado del término "regula" incluye, pero no se limita a, regular hacia arriba o regular hacía abajo, para fijar, para dar orden o uniformidad, para controlar, o para dirigir por diferentes medios. En un aspecto, un anticuerpo puede usarse en un método para el tratamiento de un "trastorno de la angiogénesis elevada" o "trastorno de la angiogénesis reducida1'. Como se utiliza en la presente, un "trastorno de la angiogénesis elevada" es aquel que incluye una angiogénesis deseada o elevada en la manifestación biológica de la enfermedad, el desorden y/o la condición; en la cascada biológica que lleva al trastorno; o como un síntoma del trastorno. De igual forma, el "trastorno de la angiogénesis reducida" es aquel que incluye la angiogénesis reducida o deseada en las manifestaciones biológicas. Esta "intervención" de la angiogénesis en el trastorno de la angiogénesis elevada/reducida incluye, pero no se limita a, lo siguiente: (1) La angiogénesis como "causa" del trastorno o manifestación biológica, ya sea el nivel de la angiogénesis elevado o reducido genéticamente, por infección, por autoinmunidad, trauma, causas biomecánicas, estilo de vida, o por alguna otra causa. (2) La angiogénesis como parte de la manifestación observable de la enfermedad o el trastorno. Es decir, la enfermedad o el trastorno se mide en términos de angiogénesis aumentada o reducida. Desde el punto de vista clínico, la angiogénesis indica la enfermedad; no obstante, la angiogénesis no necesita ser el "sello" de la enfermedad o el trastorno. (3) La angiogénesis es parte de la cascada bioquímica o celular que resulta en la enfermedad o el trastorno. Respecto a ésto, la regulación de la angiogénesis puede interrumpir la cascada, y puede controlar la enfermedad. Ejemplos no limitantes de trastornos regulados por la angiogénesis que pueden ser tratados por la presente invención se describen más adelante en la presente. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con la neovascularización retinal/coroidal que incluye, pero no se limita a, renitopatia diabética, degenaración macular, cáncer, anemia falciforme, sarcoma, sífilis, seudoxanthoma elasticum, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, inflamación crónica de la úvea/vitrítis, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematosis sistémico, retinopatía de la prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones que provocan retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de la retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, trauma y complicaciones post-láser. Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas con la rubeosis (neovascularización del iris) y enfermedades causadas por la proliferación anormal del tejido fibrovascular o fibroso, incluso todas las formas de vitreoretinopatía proliferativa, esté asociada o no con la diabetes. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para tratar enfermedades asociadas con la inflamación crónica. Enfermedades con síntomas de inflamación crónica incluyen enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, soriasis, sarcoidosis y artritis reumatoidea. La angiogénesis es un elemento clave común en estas enfermedades inflamatorias crónicas. La inflamación crónica depende de la formación continua de proliferaciones capilares que mantienen un influjo de células inflamatorias. El influjo y la presencia de células inflamatorias produce granulomas y, por ello, mantienen el estado inflamatorio crónico. La inhibición de la angiogénesis mediante las composiciones y métodos de la presente invención prevendrían la formación de los granulomas y alivianan la enfermedad. La enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa se caracterizan por la inflamación crónica y la angiogénesis en sitios diversos en el tracto gastrointestinal. La enfermedad de Crohn se caracteriza por la inflamación crónica granulomatosa a través del tracto gastrointestinal formado de nuevas proliferaciones capilares rodeado de un cilindro de células inflamatorias. La prevención de la angiogénesis inhibe la formación de las proliferaciones y evita la formación de granulomas. La enfermedad de Crohn se produce como una enfermedad inflamatoria transmural crónica que comúnmente afecta al íleon distal y al colon pero puede además ocurrir en cualquier parte de tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano y el área perianal. Los pacientes con enfermedad de Crohn generalmente tienen diarrea crónica asociada con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso e hinchamiento abdominal. La colitis ulcerosa es además una enfermedad ulcerosa, inflamatoria, no especifica y crónica que se produce en la mucosa colónica y se caracteriza por la presencia de diarrea sangrante. Las enfermedades inflamatorias del intestino muestran manifestaciones extra intestinales tales como lesiones de la piel. Esas lesiones se caracterizan por inflamación y angiogénesis y puede producirse en cualquier lugar que no sea el tracto gastrointestinal. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser capaces de tratar estas lesiones evitando la angiogénesis, reduciendo así el influjo de las células inflamatorias y la formación de lesiones.

La sarcoidosis es otra enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza como un trastorno granulomatoso multisistémico. Los granulomas de este trastorno puede formarse en cualquier parte del cuerpo y así los síntomas dependen del lugar de los granulomas y si la enfermedad está activa. Los granulomas se crean mediante proliferaciones capilares angiogénicas que proporcionan un suministro constante de células inflamatorias. Los anticuerpos de la presente invención pueden tratar las condiciones inflamatorias crónicas asociadas con la soriasis. La soriasis, una enfermedad de la piel, es otro trastorno recurrente y crónico que se caracteriza por las pápulas y las placas de vahos tamaños. La prevención de la formación de los nuevos vasos sanguíneos necesarios para mantener las lesiones características llevan a aliviar los síntomas. La artritis reumatoidea es un trastorno inflamatorio crónico caracterizado por la inflamación no específica de las uniones periféricas. Se cree que los vasos sanguíneos en el revestimiento sinovial de las uniones sufren de angiogénesis. Además de formar nuevas redes vasculares, los factores que liberan células endoteliales y especies reactivas del oxígeno que llevan al crecimiento de la queratitis vascular y a la destrucción del cartílago. Los factores incluidos en la angiogénesis pueden contribuir de forma activa, y pueden ayudar a mantener el estado inflamado crónicamente de la artritis reumatoidea. Otros trastornos que pueden tratarse de conformidad con la presente invención son los hemangiomas, el trastorno de Osler-Weber- Rendu, o la telangiectasia hemorrágica hereditaria, y tumores de transmisión sanguínea o sólidos y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse además para tratar un "trastorno de la angiogénesis reducida". Como se utiliza en la presente, un "trastorno de la angiogénesis reducida" es aquel donde la angiogénesis podría considerarse beneficiosa para tratar una enfermedad, trastorno, o condición. El trastorno es aquel caracterizado por el tejido que sufre o está en riesgo de sufrir daño isquémico, infección o una mala curación, lo cual resulta cuando el tejido es privado de un suministro adecuado de sangre oxigenada debido a una mala circulación. Como se utiliza en la presente, "tejido" se usa en un sentido más amplio, para incluir, pero sin limitarse a, lo siguiente: tejido cardíaco, tal como los ventrículos del miocardio y cardíaco; el tejido eréctil; el músculo del esqueleto; el tejido neurológico, tal como el cerebelo; los órganos internos, tales como el cerebro, el corazón, páncreas, hígado, bazo y pulmones; o áreas generalizadas del cuerpo tales como las extremidades completas, un pie, o los miembros distales tales como dedos de las manos o pies. Métodos de vascularización de los tejidos isquémicos En un aspecto, los anticuerpos pueden usarse en un método de vascularización de tejidos isquémicos. Como se utiliza en la presente, "tejidos isquémicos," se refiere al tejido que es privado de una adecuada circulación sanguínea. Ejemplos de tejidos isquémicos incluyen, pero no se limitan a, tejidos que no tienen una adecuado suministro sanguíneo que resulta en infartos cerebrales y del miocardio, isquemia en el miembro o isquemia mesentérica, o el resultado de oclusiones vasculares o estenosis. En un ejemplo, la interrupción del suministro de la sangre oxigenada puede ser provocada por una oclusión vascular. Esa oclusión vascular puede ser provocada por arteriesclerosis, trauma, procedimientos quirúrgicos, trastornos, u otras etiologías. Las técnicas de la rutina estándar están disponibles para determinar si un tejido está en riesgo de sufrir daño isquémico de una oclusión vascular no deseada. Por ejemplo, en los trastornos del miocardio estos métodos incluyen una variedad de técnicas de imagen (p. ej., metodologías de radiotrazador, rayos x y MRI (Resonancia Magnética) y exámenes fisiológicos. Por ello, la inducción de la angiogénesis es un medio efectivo para evitar o atenuar la isquemia en tejidos afectados por o en riesgo de sufrir una oclusión vascular. Además, se contempla totalmente el tratamiento del músculo del esqueleto y de la isquemia del miocardio, ataque cardíaco, trastorno de la arteria coronaria, trastorno vascular periférico, trastorno de la arteria coronaria. Una persona con experiencia en la industria que usa técnicas estándar puede medir la vascularización del tejido. Ejemplos no limitantes de medición de la vascularización en un individuo incluyen SPECT (tomografía por emisión de fotón único); PET (Tomografía por emisión de positrones); MRI (resonancia magnética); y combinaciones de éstos, al medir la circulación sanguínea del tejido antes y después del tratamiento. La angiografía puede usarse como una evaluación de la vascularidad macroscópica. La evaluación histológica puede usarse para cuantificar la vascularidad en el nivel de vaso pequeño. Estas técnicas y otras se discuten en Simons, y col., "Clinical triáis in coronan/ angiogenesis" (Exámenes clínicos en la angiogénesis coronaria), Circulation (Circulación), 102, 73-86 (2000). Métodos para reparar tejidos En un aspecto, los anticuerpos pueden usarse en un método para reparar tejidos. Como se utiliza en la presente, "reparar tejidos" se refiere a promover la reparación del tejido, regeneración, crecimiento, o mantenimiento, incluso, pero sin limitarse a, la reparación de una herida o la ingeniería del tejido. Una persona con experiencia en la industria aprecia que la formación del nuevo vaso sanguíneo es necesaria para la reparación del tejido. A su vez, el tejido puede dañarse por, incluso, pero sin limitarse a, heridas traumáticas o condiciones que incluyen artritis, osteoporosis y otros trastornos del esqueleto, y quemaduras. El tejido puede dañarse además por heridas debido a procedimientos quirúrgicos, irradiación, laceración, químicos tóxicos, infecciones virales o bacterianas, o quemaduras. El tejido que necesita ser reparado además incluye heridas que no se curan. Ejemplos de heridas que no se curan incluyen úlceras de la piel que no se curan que resultan en una patología diabética; o fracturas que no se curan fácilmente. Los anticuerpos pueden ser usados además en la reparación de tejidos en el contexto de los procedimientos de regeneración tisular guiada (GTR). Aquellas personas con experiencia en la industria usan esos procedimientos actualmente para acelerar la curación de heridas siguiendo procedimientos quirúrgicos invasivos.

Los anticuerpos pueden usarse en un método para promocionar la reparación de tejidos caracterizados por el crecimiento aumentado del tejido durante el proceso de ingeniería del tejido. Como se utiliza en la presente, "ingeniería del tejido" se define como la creación, diseño, y fabricación de los dispositivos protésicos biológicos, en combinación con materiales sintéticos o naturales, para el incremento o el reemplazo de tejidos y órganos corporales. Por ello, los métodos actuales pueden usarse para aumentar el diseño y el crecimiento de los tejidos humanos fuera del cuerpo para su implantación posterior en la reparación o reemplazo de los tejidos enfermos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser útiles para promover el crecimiento de las reposiciones de los injertos de piel que se usan como terapia en el tratamiento de las quemaduras. En otro aspecto de la ingeniería del tejido, los anticuerpos de la presente invención pueden incluirse en los dispositivos que contienen células o libres de células que inducen la regeneración de los tejidos humanos funcionales cuando se implantan en un lugar que requiere regeneración. Como se discutió anteriormente, la regeneración tisular guiada por biomateriales puede usarse para promover el recrecimiento óseo en, por ejemplo, enfermedad periodontal. Por ello, los anticuerpos pueden usarse para promover el crecimiento de tejidos reconstituidos ensamblados en configuraciones tridimensionales en el lugar de una herida u otro tejido que necesita reparación. En otro aspecto de la ingeniería del tejido, los anticuerpos pueden incluirse en dispositivos externos e internos que contienen tejidos humanos diseñados para reemplazar la función de los tejidos internos enfermos. Este enfoque incluye células aisladas del cuerpo, colocándolas con matrices estructurales, e implantando el nuevo sistema dentro del cuerpo o usando el sistema fuera del cuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos pueden incluirse en un injerto vascular con revestimiento celular o promover el crecimiento de células contenidas en el injerto. Se visualiza que los métodos de la invención pueden usarse para aumentar la reparación de tejidos, regeneración e ingeniería en productos tales como cartílago y hueso, tejidos del sistema nervioso central, músculo, hígado y células del islote pancreático (generadoras de insulina). Formulaciones farmacéuticas y métodos de uso Los anticuerpos de la invención pueden administrarse a los individuos para tratar o prevenir enfermedades o trastornos que se regulan mediante los genes y las proteínas de la invención. En la presente, el término "tratamiento" se utiliza para dar a entender que la administración de un compuesto de la presente invención mitiga una enfermedad o un trastorno en un receptor. Por consiguiente, el término "tratamiento" incluye las acciones de prevenir la aparición de un trastorno en un receptor, especialmente cuando el receptor tiene predisposición a adquirir la enfermedad, pero todavía no ha sido diagnosticado con ella; inhibir el trastorno; o aliviar o revertir el trastorno. En la medida en que los métodos de la presente invención están dirigidos a la prevención de trastornos, se entiende que el término "prevenir" no requiere que el trastorno sea completamente combatido. (Ver Webster's Ninth Collegiate Dictionary.) Más bien, como se utiliza en la presente, el término "prevenir' se refiere a la habilidad de aquellos con conocimiento en la industria para identificar una población que sea susceptible a los trastornos, de manera que los compuestos de la presente invención puedan administrarse antes del comienzo de una enfermedad. El término no implica que se pueda evitar por completo el estado de la enfermedad. Los compuestos identificados por los métodos de análisis de la presente invención pueden administrarse junto con otros compuestos. La seguridad y eficacia terapéutica de los compuestos identificados puede determinarse por medio de los procedimientos estándar utilizando tecnologías in vitro o in vivo. Pueden preferirse los compuestos que muestran índices terapeúticos grandes, aunque los compuestos con menor índice terapéutico pueden ser útiles si el nivel de los efectos colaterales es aceptable. Los datos obtenidos con las técnicas toxicológicas y farmacológicas in vitro e in vivo pueden utilizarse para formular el intervalo de dosis. La efectividad de un compuesto puede además evaluarse en modelos animales o en exámenes clínicos de pacientes con angiogénesis regulada indebidamente o no regulada. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable*' intenta incluir todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos y agentes antifúngicos, agentes ¡sotónicos, agentes retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración farmaceútica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la industria. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, esos medios pueden usarse en las composiciones de la invención. Los compuestos activos complementarios pueden además incorporarse en las composiciones. Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con la vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, por vía oral (p. ej., inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: Un diluyente estéril como el agua para inyección, solución salina, aceites fijos, glicoles de polietileno, glicerina, glicol de propileno, u otros solventes sintéticos; agentes antíbacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácido o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua), o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen salino fisiológico, agua bacteriostática, CREMOPHOR EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o. En todos casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto que permita la administración con jeringa fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej. , glicerol, propilen glicol, y glicol de polietileno liquido, y similares), y combinaciones adecuadas de éstos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes bacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabéns, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de ingredientes enumeradas anteriormente, como sea requerido, seguido de la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacio y el secado por congelamiento, que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada con filtro de ese ingrediente adicional. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transdérmica o transmucosa, se utilizan en la formulación los penetrantes adecuados para la barrera que debe atravesarse. Esos penetrantes se conocen de manera generalizada en la industria e incluyen, por ejemplo, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico para la administración transmucosa. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los activos compuestos están formulados como pomadas, ungüentos, geles o cremas, como se conocen de manera generalizada en la industria. Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (p. ej., con bases convencionales para supositorios tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o de enemas de retención para suministro rectal.

En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra cualquier eliminación rápida del cuerpo tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para preparar tales formulaciones serán claros para aquellos con conocimiento en la industria. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones de liposomas (incluyendo liposomas destinados a las células infectadas con anticuerpos monoclonales en antígenos virales) también pueden usarse como portadores aceptables farmacéuticamente. Estos pueden prepararse de conformidad con los métodos conocidos por aquellas personas con experiencia en la industria, por ejemplo, como se describe en la patente de los EE.UU. núm. 4,522,81 1 . Resulta especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y que la dosis sea uniforme. "Forma unitaria de dosificación", como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente distintas adaptadas de acuerdo a las dosificaciones unitarias para el individuo a tratar, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las forma unitaria de dosificación se dictan mediante y dependen directamente de la única característica del compuesto activo y el efecto terapeútico específico a lograr, y las limitaciones propias en la industria de componer ese compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Ejemplos Ejemplo 1 . La producción de la proteína de dominio extracelular HPTP3. Métodos: El ????ß de longitud total se reproduce de una biblioteca placentaria humana de conformidad con las instrucciones del fabricante (Origene). La copia es idéntica a la copia de cDNA informada anteriormente (acceso Genbank # X54131 ) excepto que pierde FNIII repetición n° 5. Un cDNA que codifica el dominio extracelular soluble completo (ECD) de ????ß es reproducido por PCR desde el cDNA de longitud total (ver secuencia debajo) con código AA 1-1534 con un terminal-c agregado His-His-H'is-His-His-His-Gly (6His-Gly) (sec. con núm. de ident. 1 ). El cDNA resultante se reproduce en vectores de expresión mamífera para expresiones transitorias (pShuttle-CMV) o estables (pcDNA3.1 (-)) en células HEK293. Para obtener ????ß ECD (ß ECD) purificado, se incuban las células HEK293 transfectadas con un ß vector de expresión ECD en OptiMEM libre de suero (Gibco) durante 24 horas bajo condiciones normales de crecimiento. Los medios condicionados luego se recuperan, centrifugados para eliminar el desecho (1000 rpm x 5 minutos), y se agrega 1 mi de agarosa lavada Ni-NTA (Qiagen) (500 pL de material compactado) cada 10 mi de medios claros permitiendo que se sacudan durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, la mezcla se carga en una columna y se lava con 20 volúmenes de lecho de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI, 20 mM de imidazol, pH 8. La proteína de dominio extracelular purificada ????ß (sec. con núm. de ident. 2) luego se extrae con solventes en seis fracciones con 200 pL/por elución en 50 mM NaH2P04, 300 mM NaCI, 250 mM de imidazol, pH 8. Se analiza el contenido de proteínas de las fracciones usando electroforesis en gel SDS-poliacrilimida reductor y desnaturalizante y se detecta mediante una mancha de plata (Invitrogen) y se confirma mediante espectometría de masa. Resultados: Para desarrollar un anticuerpo en un dominio extracelular de ????ß?, se desarrollan los vectores de expresión que dirigen la expresión de una proteina extracelular de dominio 6-His tagged ????ß (Figuras 1A y 1 B, Figura A). Posteriormente, la proteína extracelular de dominio 6-His tagged ????ß se purifica cerca de la homogeneidad (Figura 1A y 1 B, Figura B) de los medios condicionados de las células HEK293 transfectadas con el vector de expresión.

Ejemplo 2. La generación de anticuerpos monoclonales en el dominio extracelular ????ß. Métodos: Para la producción del inmunógeno del dominio extracelular del ????ß, se conjuga la proteína 6His del dominio extracelular de ????ß purificada con tiroglobulina porcina (Sigma) usando química de acoplamiento EDC (Hockfield, S. y col., (1993) Cold Spring Habor Laboratory Press. Volume 1 pp. 1 1 1 -201 , Immunocytochemistry (Inmunocitoquímica)). El conjugado de tiroglobulina resultante del dominio extracelular ????ß se dializa en contra de PBS, pH 7.4. Ratones adultos Balb/c luego son inmunizados de forma subcutánea con el conjugado (100-200 pg) y se completan con el adyuvante de Freund en una mezcla 1 a 1 . Después de dos 0 tres semanas, se inyecta en el interperitoneo o de forma subcutánea el adyuvante incompleto de Freund y el conjugado en los ratones en una mezcla 1 a 1 . La inyección se repite de 4 a 6 semanas. Se obtiene suero de ratones 7 días después de la tercera inyección y se ensaya para inmmunoreactividad en el antígeno del dominio extracelular ????ß mediante ELISA y westem blotting. Los ratones que muestran una buena respuesta al antigeno son estimulados mediante una sola inyección intra-bazo con 50 pL de proteína de dominio extracelular ????ß purificada mezclada 1 : 1 con hidróxido de aluminio usando una aguja extra larga calibre 31 (Goding, J. W., (1996) Monoclonal Antibodies: Principies and Practices (Anticuerpos monoclonales: Principios y Prácticas). Tercera edición, Academic Press Limited, pág. 145). Brevemente, los ratones son anestesiados con avertin al 2.5 %, y se crea una incisión de 1 centímetro en la piel y la pared del cuerpo queda oblicua. La mezcla de antígenos se administra insertando la aguja desde la porción posterior hacia la porción anterior del bazo en una inyección longitudinal. La pared del cuerpo se sutura y la piel se sella con dos clips pequeños de metal. Los ratones son monitoreados para una recuperación segura. Cuatro días después de la cirugía el bazo del ratón se saca y se realizan suspensiones simples de células para fusión con células de mieloma de ratón para la realización de lineas celulares de hibridoma (Spitz, M., (1986) Methods In Enzymology, Volume 121 (Métodos en enzimología, Volumen 121 ). Eds. John J, Lagone y Helen Van Vunakis. págs. 33-41 (Academic Press, New York, NY)). Los hibridomas resultantes se cultivan en medios Dulbecco modificados (Gibco) complementados con el 15 % de suero de ternero fetal (Hyclone) e hipoxatina, aminopterina y timidina. El tamizado de los hibridomas positivos comienza 8 días después de la fusión y continúan durante 15 días. Los hibridomas que producen anticuerpos de dominio extracelular anti-????ß se identifican mediante la técnica ELISA en dos grupos de platos de 96 pocilios: uno revestido con el dominio extracelular ????ß y otro revestido con proteína MurA bacteriana marcada con histidina como un control negativo. El anticuerpo secundario es un IgG de burro anti ratón rotulado como peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch). La inmunoreactividad se monitorea en pocilios usando desarrollo de color iniciado por las tabletas ABTS disueltas en tampón TBS, pH 7.5. Las mezclas de reacción HRP del individuo se finalizan agregando 100 microlitros de SDS al 1 % y leyendo la absorbancia a 405 nm con espectofotómetro. Los hibridomas que producen anticuerpos que interactúan con el dominio extracelular-6His ????ß, y no con la proteína murA-6His se usan para análisis adicionales. Las diluciones restrictivas (0.8 células por pocilio) se realizan dos veces en copias positivas en platos de 96 pocilios, con clonalidad definida como mayor que 99 % de los pocilios con reactividad positiva. Los isótopos de los anticuerpos se determinan usando la tecnología isostrip (Roche). Para obtener anticuerpo purificado para otra evaluación, los sobrenadantes de cultivo de tejido se purifican por afinidad usando una proteína A o columnas de la proteína G. Resultados: Se aislan cinco anticuerpos monoclonales inmunorreactivos en la proteína de dominio extracelular ????ß y se da la siguiente nomenclatura, R15E6, R12A7, R3A2, R1 1 C3, R15G2 y R5A8. El anticuerpo monoclonal R15E6 se deposita con la American Type Culture Collection (Colección Americana de Tipos de Cultivos) (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA el 4 de mayo de 2006.

Ejemplo 3. R15E6 liga la HPTP3 endógena con las células endoteliales humanas. A. R15E6 liga la ????ß endógena como se ha demostrado mediante la inmunoprecipítación y western blot. Materiales: células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs), medios EGM, y solución neutralizante de tripsina de Cambrex; OPTIMEM I (Gibco), albúmina de suero bovino (BSA; Santa Cruz), salino tamponado con fosfato (PBS; Gibco), Factores de crecimiento incluyendo Angiopoietina 1 (Ang1 ), factor de crecimiento vascular endoteiial (VEGF) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (R&D Systems), anticuerpo monoclonal Tie2 (Duke University/P&GP), anticuerpo policlonal del receptor 2 VEGF (VEGFR2) (Whitaker y col.), proteína A/G agarosa (Santa Cruz), sistema de transferencia/electroforesis en gel pre cast de Tris-Glicina(6-8 %) (Invitrogen), membranas PVDF (Invitrogen), tampón para lisis (20 mm Tris-HCI, 137 mm NaCI, 10 % glicerol, 1 % triton-X-100, 2 mM EDTA, 1 mM NaOV, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 1 pg/ml leupeptina, 1 pg/ml pepstatina). Método: Los HUVECs se tratan previamente durante 30 minutos con anticuerpo (en OPTIMEM) o OPTIMEM I sólo. Después de eliminar el tratamiento previo, las células se tratan con Ang1 (100 ng/ml) durante 6 minutos en PBS + 0.2 % BSA y se lisan en tampón para lisis. Los lisatos se corren directamente en gel de Tris-Glicina o se inmunoprecipitan con 2-5 pg/ml de anticuerpo Tie-2 o 10 pg/ml de anticuerpo R15E6 y proteína A/G agarosa. Las muestras inmuprecipitadas se enjuagan en 1x con tampón de lisis y se hierven durante 5 minutos en 1 x tampón de muestra. Las muestras se resuelven en gel de Tris-Glicina, transferido a una membrana PVDF, y se detectan mediante western blot usando los anticuerpos indicados (pTYR Ab (PY99, Santa Cruz), Tie-2, VEGFR2 o R15E6). Resultados: Mediante IP/western blotting, R15E6 reconoce una banda de alto peso molecular consistente con el tamaño de ????ß (Figuras 2A y 2B, Figura A, Pasaje 2). Cuando menos intensas, las banda de peso molecular inferior probablemente representen formas precursoras glicosiladas de ????ß. Una inmunoprecipitación (IP) con gG no-inmune de control no muestra bandas en el rango de peso molecular de la ????ß (Figuras 2A y 2B, Figura A, Pasaje 1 ), y un Tie2/VEGFR2 IP combinado muestra bandas del peso molecular esperado (Figuras 2A y 2B, Figura A, Pasaje 3). Este resultado demuestra que R15E6 reconoce y es específico para ????ß. B. R15E6 liga HPTP endógeno ß como lo ha demostrado el análisis FACS Materiales: Los HUVECs, los medios EGM, y la solución neutralizante de tripsina de Cambrex; Anticuerpo secundario Alexfluor marcado 488 de Molecular Probes; solución salina balanceada de Hanks (Gibco); FACSCAN y software CellQuest software de Becton Dickenson. Método: Los HUVECs se tripsinizan, tratados con solución neutralizante de tripsina y se enjuagan con HBSS. El anticuerpo R15E6 (0.6 pg) se agrega a 250,000 células en 50 pL de HBSS y se incuban en hielo durante 20 minutos. Las células se enjuagan con 1 mi de HBSS seguido del agregado de 2 pg de anticuerpo secundario conjugado fluorescente durante 20 minutos en hielo. Las células se enjuagan y se resuspenden en 1 mi de HBSS luego se analizan en el citómetro de flujo FACSCAN con el software CellQuest. Las células control se tratan solamente con anticuerpo secundario conjugado fluorescente. Resultados: Mediante análisis FACS, los HUVECs intactos, R15E6 causan una modificación contundente (>90 % de las células) en la señal de fluorescencia comparado con el anticuerpo secundario solo (Figuras 2A y 2B, Figura B). Este resultado indica que el R15E6 liga ????ß endógeno presente en la superficie de las células endoteliales intactas.

Ejemplo 4. R15E6 aumenta la activación de T¡e2, y promueve múltiples respuesta angiogénicas (subsistencia de las células endoteliales, migración y morfogénesis capilar). A. R15E6 aumenta la fosforilación de Tie2 en ausencia y presencia de la angiopoietina 1 (Ang1 ), el ligando de Tie2. Métodos: los HUVECs se cultivan en medios libres de suero, como se describió anteriormente, en presencia o ausencia de varias concentraciones de R15E6 y con o sin Ang1 agregada. Los lisatos se preparan, inmunoprecipitan con anticuerpo Tie2, resuelto mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfieren a una membrana PVDF. Las proteínas inmunoprecipitantes unidas a la membrana luego se analizaron por western blot en serie con un anticuerpo de antifosfotirosina para cuantificar la fosforilación Tie2 seguida de un anticuerpo Tie2 para cuantificar el Tie2 total. La fosforilación Tie2 se expresa como la relación de la señal antifosfotirosina sobre la señal Tie2 total. Resultados: El R15E6 aumenta la fosforilación Tie2 en ausencia y en presencia de Ang1 (Figura 3). Este resultado indica que la aglutinación de R15E6 con ????ß en la superficie de las células endoteliales modula su función biológica dando como resultado una activación de Tie2 en ausencia o en presencia del ligando. B. El R15E6 aumentan la subsistencia de las células endoteliales en presencia y en ausencia de los factores de crecimiento endoteliales.

Materiales: Los HUVECs, los medios EGM, y la solución neutralizante de tripsina de Cambrex; DMEM (Cell Gro), BSA delipidizada (BD Falcon), Ensayo de ATP Cell Titer-Glo (Promega), Factores de crecimiento (Ang1 , VEGF 165, and FGF) (R&D Systems), (Perkin Elmer Wallac). Método: Los HUVECs se colocan en 10,000 células/pocilio, sin suero en DMEM/0.2 % BSA y tratadas durante 72 horas en presencia o ausencia del factor de crecimiento (Ang1 , VEGF, o FGF), con o sin concentraciones diversas de anticuerpo R15E6. Después de 72 horas, las células se enjuagan con DMEM y las células sobrevivientes se cuantifican midiendo los niveles ATP usando el Ensayo de Luminiscencia Cell Titer Glo de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Promega). Resultados: En consistencia con los resultados del ensayo de activación de Tie2, el R15E6 aumenta la subsistencia de las células endoteliales en ausencia del factor de crecimiento agregado en concentraciones entre 0.5 y 5 nM (Figuras 4A-4D, Figura A). De igual forma, el R15E6 aumenta la subsistencia de las células endoteliales mediadas por Ang1 (Figuras 4A-4D, Figura A) así como la subsistencia de la célula mediada por VEGF y FGF (Figuras 4A-4D, Figuras B y C). No se ve ninguna subsistencia aumentada con un anticuerpo monoclonal de control (Figuras 4A-4D, Figura D). Estos resultados demuestran que el R15E6 unido a ????ß en la superficie de células endoteliales aumenta la subsistencia de las células endoteliales de los valores iniciales así como la subsistencia de la célula mediada por rutas angíogénicas múltiples (Ang1 , VEGF, y FGF).

C. El R15E6 aumenta la migración de las células endoteliales en presencia y en ausencia de VEGF. Materiales: Los HUVECs, los medios EGM, y la solución neutralizante de tripsina de Cambrex; EBM libre de fenol rojo (PRF-EBM, Cambrex), BSA delipidizada (BD Falcon), sistema de migración de células endoteliales BD Falcon Biocoat (BD Falcon), Calceina AM (Molecular Probes), factores de crecimiento (VEGF 165) (R&D Systems), lector de placa Víctor V Multilabel (Perkin Elmer Wallac). Método: Los HUVECs se resuspenden en PRF-EBM+0.1 % BSA y se colocan en 50,000 células/pocilios (BD Bioscience, tamaño del poro 3 µ??). El factor de crecimiento/ R15E6 se coloca en la parte inferior del pocilio de la cámara transwell" y se incuban de 4 a 22 horas. La células que migran a través de la membrana se detectan rotulando con 4 pg/ml de Calceina AM durante 90'. La fluorescencia se mide usando un instrumento Víctor V (485/535). Resultados: Consistente con los resultados en el estudio de subsistencia, R15E6 aumenta la migración de células endoteliales mediadas por VEGF y los valores iniciales (Figura 5). D. R15E6 aumenta la proliferación de células endoteliales y la morfogénesis capilar en presencia y en ausencia de factores de crecimiento endoteliales. Materiales: Los HUVECs y los medios EGM de Cambrex; Los glóbulos del tipo Cytodex y el colágeno tipo I de Sigma; PBS Dulbecco's y los medios M199 de Gibco; VEGF de R&D.

Método: El pasaje 4 de HUVECs (2x106 células) se cultiva con 5 mg de glóbulos del tipo Cytodex en 10 mi de EGM en 100 mm de placas bacteriológicas con cultivo de no tejidos tratados durante 48 horas con remolino ocasional. Los glóbulos revestidos por células se transfieren a un tubo cónico de 50 mi y se resuspenden en 380 pL de D-PBS. Los geles de colágeno se preparan agregando 71.4 pL de glóbulos revestidos por células en 2.8 mi de una solución de matriz que consiste de 3 mg/ml de colágeno en medios M 99 complementados con 0.005 N NaOH, 20 mM HEPES, y 26 mM NaHCO3. Trescientos cincuenta microlitros de glóbulos se dispensan en un pocilio de una placa para cultivo de tejidos de 24 pocilios y permiten que la matriz se solidifique durante 1 hora a 37 °C/5 % C02. Se agrega un mi de medio EGM con o sin VEGF (10 ng/ml) o R15E6 (7.5 pg/ml) por pocilio y se regresa al incubador. Después de 48 horas, un observador ciego visualiza la proliferación con un microscopio invertido de contraste de fase y observa 50 glóbulos por pocilio, en pocilios triplicados, para la presencia de proliferación de células endoteliales. Los resultados se expresan como el número de proliferaciones por glóbulo. Resultados: Consistente con los resultados de los otros ensayos, el R15E6 además aumenta los valores iniciales y la morfogénesis capilar mediada por VEGF en el ensayo de proliferaciones de glóbulos endoteliales (Figura 6).

Ejemplo 5. El epitopo de unión para R15E6 está en la repetición del terminal N FN3 del dominio extracelular humano HPTP3- A. El análisis por Western blot de los mutantes de truncación del terminal c recombinante y las proteínas quimeras humanas/de ratón muestran que el epitopo de unión R15E6 está en la repetición del terminal N FN3 del dominio extracelular ????ß. Métodos: Las células HEK293 se transfectan con los vectores de expresión que codifican al mutante de truncación ????ß indicado o a la quimera humana/de ratón. Las células transfectadas luego se incuban en OptiMEM durante 24 horas adicionales después de las cuales los medios condicionados que contienen el dominio extracelular ????ß indicado son recolectados y almacenados para uso futuro o para ser usado inmediatamente por western blot o estudios ECL (ver más abajo). Para el análisis por western blot, se resuelven 20 pL medios condicionados que contienen la proteína ????ß indicada o no contienen proteína recombinante (Mock, empty vector transfected (simulado, vector transfectados vacíos)) mediante PAGE, transferido a una membrana PVDF y probado con R15E6. Resultados: Mediante el análisis por western blot, el R15E6 liga a todos los mutantes de supresión de terminal C ????ß (Figura 7A) indicando que el epitopo de unión está dentro de las dos primeras repeticiones N-terminal FN3. R15E6 no puede ligar el dominio extracelular de murina ????ß (sec. con núm. de ident. 7) demostrando especificidad para la proteína humana (Figura 7B Pasaje 6 versus Pasaje 2). Reemplazando las murinas 1 o y 1 o y las repeticiones 2° N-terminal FN3 con el aglutinante R15E6 restaurado por las secuencias humanas (Figura 7B Pasajes 3 y 5). Inversamente, el reemplazo solo de la 2o repetición FN3 de murina con la secuencia humana no puede restaurar la aglutinación. (Figura 7B Pasaje 4). Juntos, estos hallazgos localizan el epítopo de unión de R15E6 con la repetición N-terminal FN3 (~100 aminoácidos) de ????ß humano. B. El análisis ECL (electroquimioluminiscente) de los mutantes de truncación del terminal y las proteínas quimeras humanas/de ratón confirman que el epítopo de unión R15E6 está en la repetición del N-terminal FN3 del dominio extracelular ????ß. Métodos. Los sobrenadantes que contienen la proteínas ????ß indicadas son recubiertas en una placa de 96 pocilios MSD (Meso Scale Discovery) de alta capacidad de unión, se dejan secar, y se bloquean con 3 % BSA durante 1 hora. La proteína luego se incuba con el anticuerpo R15E6 monoclonal o el fragmento R15E6 Fab (10 nM o 1 .5 pg/ml) durante 1 hora, enjuagado, e incubado con anticuerpo de cabra anti-ratón con una etiqueta MSD-Tag (10 nM) durante 1 hora. El anticuerpo excedente se enjuaga y se agrega tampón de lectura MSD. La emisión de la luz se mide usando el lector Sector 2400 (MSD). MSD utiliza la detección electroquimioluminescente para detectar los casos de unión en series estructuradas. La tecnología Meso Scale Discovery (MSD) usa propiedad MULTI-ARRAY™ y microplacas MULTI-SPOT™ con electrodos integrados en la parte inferior de la placa. Los electrodos MSD se fabrican de carbono y los reactivos biológicos pueden unirse al carbono simplemente mediante absorción pasiva y retienen un alto nivel de actividad biológica. Los ensayos MSD usan etiquetas electroquimioluminiscentes para detección ultrasensible. Estas etiquetas electroquimioluminiscentes emiten luz cuando se estimulan electromecánicamente. El proceso de detección se inicia en los electrodos incorporados ubicados en la parte inferior de las microplacas MSD y solo las etiquetas cercanas a los electrodos se estimulan y la luz se detecta a 620 nm. Resultados: Consistente con los estudios por western blot, el R15E6 liga todas las proteínas de truncación terminal C ????ß mediante el análisis MSD (Figura 8A). También consistente con el análisis por western blot, el R15E6 no puede ligar el dominio extracelular ????ß de murina pero la unión se restaura reemplazando la repetición N-terminal FN3 de murina con el dominio humano N-terminal FN3 (Figura 8B). Estos datos confirman que el epítopo de unión de R15E6 está en la repetición N-terminal FN3 de ????ß humano. Como era sabido, el epítopo de unión del fragmento Fab R15E6 monovalente podría además ser mapeado en la mayoría de la repetición FN3 del N-terminal del ????ß humano (Figuras 9A y 9B).

Ejemplo 6. Un fragmento Fab R15E6 monovalente bloquea la activación Tie2 mediada e inhibe la subsistencia de las células endotelíales y la migración. Métodos: La activación Tie2 y la subsistencia de las células endotelíales y los ensayos de migración se realizan de acuerdo a la descripción anteriormente mencionada en el Ejemplo 4. El fragmento Fab R15E6 monovalente se prepara como se describió previamente. El R15E6 purificado se dializa en 0.1 M de Tris-HCL, pH 8.0, conteniendo 2 mM de EDTA y 1 mM de Ditiotreitol. La papaína (Pierce) en 1-2 mg/ml se activa en el tampón mencionado anteriormente durante 15 minutos a 37 °C. El R15E6 a 10 mg/ml se incuba con papaína en el mismo tampón usando una enzima: relación del sustrato de 1 :100, durante 1 hora a 37 °C. La digestión termina por la adición de iodoacetamida (concentración final 20 mM, y mantenida en hielo durante 1 hora, protegida de la luz. El material digerido de papaína se dializa durante la noche contra salina tamponada con fosfato, para eliminar la iodoacetamida. El alcance de la digestión se monitorea mediante SDS-PAGE con la desaparición de la cadena pesada del tipo gamma (MW 9.1329E-17E g (55,000 kDa)) y la aparición del fragmento Fe del tipo gamma (MW 4.4834E-17 g (27,000 kDa)) y cadenas de luz (MW 3.6532E-17 g (22,000-25,000 kDa)). Resultados: A diferencia del anticuerpo R15E6 intacto, los fragmentos Fab no pueden aumentar la activación de Tie2 (Figura 10). Además, en la presencia de fragmento Fab excedente, se bloquea la activación de Tie-2 mediada por R15E6 (Figura 10). De forma sorprendente, el fragmento Fab R15E6 inhibe marcadamente la subsistencia de las células endoteliales comparado con un Fab de control (Figura 1 1 A) y este efecto puede redimirse agregando el R15E6 intacto (Figura 1 1 B). Consistente con el efecto negativo en la subsistencia endotelial, el R15E6 Fab además bloquea la migración de las células endoteliales mediadas por VEGF (Figura 12). Estos hallazgos demuestran que el R15E6 dímero intacto es necesario para el aumento de la señalización angiogénica y que los R15E6 monoméricos bloquean estas acciones y en realidad tienen un efecto negativo en las repuestas de las células endoteliales angiogénicas. A menos que se indique de cualquier otra forma, todas las cifras que incluyen cantidades, porcentajes, porciones y proporciones están modificados por la palabra "aproximadamente" y no pretenden indicar dígitos significativos. Excepto que se indique de otra forma, los artículos "un", "uno(a)", y "el(la)" significa "uno(a) o más". Todos los documentos citados se consideran incorporados en este documento en su parte relevante como referencia. La mención de cualquier documento no deberá interpretarse como una admisión de que éste corresponde a una industria anterior con respecto a la presente invención. En el grado en que cualquier significado o definición de un término en este documento escrito contradice cualquier significado o definición del término en un documento incorporado como referencia, el significado o definición asignado al término en este documento escrito deberá regir. Aunque se han ilustrado y descrito modalidades específicas de la presente invención, será evidente para aquellos con experiencia en la industria que pueden realizarse otros cambios y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Se ha pretendido, por consiguiente, cubrir en las reivindicaciones anexas todos los cambios y modificaciones que están dentro del alcance de la invención.

Claims (17)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 . Un anticuerpo aislado o fragmento aglutinante de antígeno de éste, que liga la proteína humana tirosina fosfatasa beta (????ß), caracterizado porque el anticuerpo o fragmento aglutinante de antígeno de éste regula la angiogénesis.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo liga la porción N-terminal de ????ß.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo liga la primera repetición FN3 de ????ß.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la primera repetición FN3 de ????ß tiene la secuencia como se indica en sec. con núm. de ident. 1 1 , o un fragmento de éste.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

6. Un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 5, producido por líneas celulares de hibridomas ATCC núm. PTA-7580 o un fragmento de un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 5, producido por las líneas celulares de hibridomas ATCC núm. PTA-7580.

7. Un anticuerpo o un fragmento aglutinante de antígenos de cualquier reivindicación precedente, en donde el anticuerpo o el fragmento aglutinante de antígenos se humaniza.

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende regiones aglutinantes de antigenos del anticuerpo monoclonal R15E6 y se humaniza.

9. El fragmento aglutinante de antigenos de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el fragmento comprende regiones variables de cadena liviana y pesada.

10. El fragmento aglutinante de antígenos de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el fragmento aglutinante de antígenos se selecciona del grupo que comprende un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento Fab', y un fragmento F(ab')2.

11. El uso de un anticuerpo o fragmento aglutinante de antígeno de éste, que liga HPTPbeta y regula la angiogénesis en la fabricación de un medicamento para uso en tratamiento de un trastorno regulado por angiogénesis.

12. El uso como se reclama en la reivindicación 1 1 , en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno elevado de angiogénesis seleccionado de la rinopatía diabética, degeneración macular, cáncer, anemia falciforme, sarcoma, sífilis, pseudoxanthoma elasticum, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de la carótida, inflamación crónica de la úvea/vitritis, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematosis sistémico, retinopatía de la prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones que provocan retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento crónico de la retina, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis, trauma y complicaciones post-láser, enfermedades asociadas con la rubeosis, y vitreoretinopatia proliferativa.

13. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 1 , en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno elevado de la angiogénesis seleccionado de enfermedades de inflamación intestinal incluyendo la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, psoriasis, sarcoidosis, artritis reumatoidea, hemangiomas, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, o telangiectasia hemorrágica hereditaria, y tumores de transmisión sanguínea o sólidos y síndrome de inmunodeficiencia adquirida.

14. El uso como se reclama en la reivindicación 1 1 , en donde el trastorno regulado por angiogénesis es un trastorno de la angiogénesis reducida seleccionado del músculo del esqueleto y la isquemia del miocardio, ataque cardíaco, trastorno de la arteria coronaria, trastorno vascular periférico, y el trastorno de la arteria coronaria, preferentemente, caracterizado además porque el trastorno de la angiogénesis reducida es un trastorno vascular periférico o trastorno de la arteria coronaria.

15. Un anticuerpo monoclonal R15E6.

16. Un anticuerpo que tiene las mismas, o sustancialmente las mismas características del anticuerpo monoclonal R15E6.

17. Una composición farmacéutica que comprende: a. un anticuerpo o un fragmento de éste de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 6, 7, 8, 15, ó 16; y b. un portador farmacéuticamente aceptable