MX2008003190A

MX2008003190A - Vectores y metodos para eficiencia de transformacion de plantas mejorada.

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Publication number: MX2008003190A
Application number: MX2008003190A
Authority: MX
Inventors: Xudong Ye; Larry A Gilbertson; Michael W Peterson
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2005-09-06
Filing date: 2006-09-06
Publication date: 2008-03-18
Also published as: WO2007030432A3; US20150232865A1; WO2007030432A2; US8993846B2; JP2016105708A; JP6077631B2; CN101305097A; JP2017074051A; US20070074314A1; JP5889508B2; EP1941046A2; CA2621394C; US20210010011A1; US20190211346A1; JP6348952B2; US10202611B2; BRPI0615680A2; JP6046079B2; JP2009506787A; EP3536793A1

Abstract

Se proveen metodos y composiciones para transformacion de plantas mediada por bacterias mejorada; los metodos generalmente permiten la transformacion de plantas con integracion de estructura de base de vector reducida y una alta frecuencia de eventos de transformacion de copia baja, se describen vectores para lograr estos resultados, asi como metodos para su uso.

Description

VECTORES Y MÉTODOS PARA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS MEJORADA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. Ser. No. 60/714,501 , presentada el 6 de septiembre de 2005, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO TÉCNICO La invención se refiere generalmente al campo de biología molecular. De manera más específica, la invención se refiere a métodos mejorados para transformación genética de plantas y composiciones para lograr la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La transformación de células vegetales por un método mediado por Agrobacterium implica exponer células y tejidos vegetales a una suspensión de células de Agrobacterium que contienen ciertos plásmídos de ADN. Estos plásmidos se han construido específicamente para contener transgenes que se expresen en células vegetales (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,034,322). Muy frecuentemente, uno o más de los transgenes es un transgen marcador seleccionable positivo que permite a las células vegetales crecer en presencia de un compuesto de selección positivo, tal como un antibiótico o herbicida. Estas células además pueden ser manipuladas para regenerarse en plantas fértiles enteras. Los métodos para introducir transgenes en las plantas por un método de transformación mediada por Agrobacterium generalmente implica un T-ADN (ADN de transferencia) que incorpora los elementos genéticos de por lo menos un transgen y transfiere esos elementos genéticos al genoma de una planta. Los transgenes son típicamente construidos en un vector plásmido de ADN y son usualmente flanqueados por un una región de ADN de borde derecho de plásmido de Agrobacterium Ti (RB) y una región de ADN de borde izquierdo (LB). Durante el proceso de transformación mediada por Agrobacterium, el plásmido de ADN es roto por una endonucleasa, VirD2, en las regiones de borde derecho e izquierda. Una sola cadena de ADN de entre las rupturas, llamada la cadena T, es transferida de la célula de Agrobacterium a la célula vegetal. La secuencia correspondiente a la región T-ADN es insertada en el genoma de la planta. La integración del T-ADN en el genoma de la planta generalmente empieza en el RB y continúa al extremo del T-ADN, en el LB. Sin embargo, las endonucleasas algunas veces no rompen igualmente en ambos bordes. Cuando esto sucede, el T-ADN que es insertado en el genoma de la planta a menudo contiene algo o todo el ADN del vector plásmido. Este fenómeno se refiere como "lectura completa de borde". Usualmente se prefiere que sólo el transgen(es) ubicado entre las regiones de borde derecho e izquierda (el T-ADN) sea transferido en el genoma de la planta sin ninguno del ADN de vector plásmído adyacente (la estructura de base del vector). El ADN de la estructura de base del vector contiene varios elementos de mantenimiento de plásmido, ¡ncluyendo, por ejemplo, origen de replicacíones, genes marcadores seleccionables bacterianos y otros fragmentos de ADN que no se requieren para expresar el rasgo(s) deseado(s) en productos de cultivo comerciales. Recursos considerables están dirigidos a la determinación selectiva del genoma de plantas de cultivo transgénicas para la presencia del ADN de la estructura de base del vector. Métodos tales como reacción de cadena de polimerasa (PCR) y análisis de Southern blot muy frecuentemente se utilizan para identificar el ADN de la estructura de base de vector extraño. Estos métodos consumen tiempo y son costosos para trabajo de determinación selectiva a gran escala. Las plantas transgénicas que se encuentra que contienen ADN de estructura de base del vector generalmente no son preferidas para comercialización. Además, Las plantas transgénicas que contienen más de dos transgenes usualmente son de poco valor para desarrollo comercial. Se han hecho esfuerzos sustanciales para regenerar plantas a partir de cultivos de células vegetales que no tienen potencial comercial. Por lo tanto, sería de gran beneficio si se pudieran desarrollar métodos y composiciones que redujeran en gran medida la aparición de ADN de estructura de base del vector en el genoma de plantas transgénicas y/o incrementaran la frecuencia de eventos de transformación de copia baja. Menos plantas transgénicas se tendrían que producir si un número mayor estuviera libre de ADN de estructura de base del vector y la mayoría de las plantas tienen una o dos copias de los transgenes, incrementando en gran medida la eficiencia de producción de plantas transgénicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION De conformidad con un aspecto de la invención, se proveen construcciones y métodos para mejorar la calidad de eventos en transformación de células vegetales mediadas por bacterias, tales como transformación de plantas mediada por Agrobacterium. La invención es ventajosa ya que provee una frecuencia reducida de ADN de estructura de base del vector, es decir, región de no T-ADN, eventos de transformación e incremento en la frecuencia de eventos de transformación de T-ADN con una o dos copias del T-ADN. La invención también provee construcciones de ADN para transformar plantas que comprenden: i) por lo menos una región de borde de T-ADN; ii) por lo menos un transgen heterólogo adyacente a la región de borde; iii) una región codificadora para un marcador seleccionable bacteriano; y iv) por lo menos un segmento de ADN, que comprende un elemento o elementos cís y/o trans de un origen de replicacíón para mantener un número de copias bajo de la construcción de ADN en una bacteria que transforma células vegetales. En ciertas modalidades de la invención, los elementos del origen de replicación para mantener el número de copias bajo de una construcción de ADN en una célula bacteriana (competente con transformación de células vegetales) que transforma células vegetales comprende uno. o más de repA (e.g. SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:38); repB (v.gr., SEQ ID NO:33 o SEQ ID NO:39); repC (v.gr., SEQ ID NO:34 o SEQ ID NO:40); ¡gs1 (v.gr., SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO:41 ); ¡gs2 (v.gr., SEQ ID NO:36 o SEQ ID NO:42). Una construcción también puede incluir opcionalmente una secuencia palindrómíca, por ejemplo, la secuencia paliondrómica de 16 pb de SEQ ID NO:37. Estos elementos pueden estar dispuestos en cis o en trans unos con respecto a otros. En algunas modalidades, la región de borde de T-ADN se define como una región de borde derecho (RB) o una región de borde izquierdo (LB). Además, en ciertas modalidades las secuencias RB y/o LB comprenden SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:44. En modalidades particulares, un transgen heterólogo cuando se expresa en una célula vegetal transformada provee un fenotipo agronómico a la célula o planta transformada derivado de la célula. En modalidades adicionales, una región codificadora para un marcador seleccionable bacteriano es un gen de resistencia a antibióticos seleccionado de gen de resistencia a kanamicina, gen de resistencia a gentamicína, gen de resistencia a cloranfenicol, gen de resistencia a espectinomícina, gen de resistencia a estreptomicina, gen de resistencia a tetraciclína, gen de resistencia a ampicilina, gen de resistencia a blasticidina, gen de resistencia a higromícina, gen de resistencia a puromicína, o gen de resistencia a Zeocina. En algunas modalidades, un origen de replicacíón comprende una secuencia de repABC seleccionada de SEQ ID NOs: 1 , 2, 3 ó 4. En una modalidad, por lo menos un segmento de ADN comprende genes de replicación repA, repB y repC. En algunas modalidades, por lo menos un segmento de ADN comprende secuencia intergénica 1 (igsl ) y secuencia ¡ntergénica 2 (¡gs2). En algunas modalidades, por lo menos un segmento de ADN comprende una secuencia palindrómica de 16 pares de bases. En otras modalidades, el segmento de ADN comprende todas las secuencias de repABC necesarias para mantener bajo el número de copias (1-3 copias por célula) en Agrobacterium u otra bacteria competente con transformación de células vegetales. Las construcciones que contienen repABC y métodos o su uso se describen con más detalle más adelante Las construcciones de ADN de la presente invención se pueden transferir a cualquier célula, por ejemplo, tal como una bacteria competente con transformación de células vegetales. Dichas bacterias son conocidas en la técnica y pueden pertenecer, por ejemplo, a las siguientes especies: Agrobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. Preferiblemente, dichas bactepas pueden pertenecer a Agrobacterium spp.

Las construcciones de ADN de la presente invención pueden comprender además uno o más orígenes de replicación para mantener copias de la construcción en E. coli. En algunas modalidades, el origen de replicación para mantener copias de la construcción en E. coli se deriva de por lo menos uno de pBR322 y pUC. La presente invención también se refiere a una bacteria de transformación de células vegetales que comprende la construcción de ADN de la presente invención, y que se puede usar para transformar una célula vegetal. En algunas modalidades, las bacterias transformantes de plantas se seleccionan de Agrobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacte um spp. Ochrobactrum spp. o Bradyrhizobium spp. La presente invención también se refiere a un método para transformar una célula vegetal que comprende: poner en contacto por lo menos una primera célula vegetal con una bacteria transformante de células vegetales de la presente invención; y seleccionar por lo menos una célula vegetal transformada con por lo menos un transgen heterólogo. En algunas modalidades, la célula vegetal es una célula de planta de soya, cañóla, maíz, o algodón. En una modalidad, un método de la invención además comprende regenerar una planta a partir de la célula vegetal. La presente invención también se refiere a un método para producir alimento, alimento para ganado o un producto industrial que comprende: obtener la planta de la presente invención o una parte de la misma; y preparar el alimento, alimento para ganado o un producto industrial a partir de la planta o parte de la misma. La invención también incluye métodos de transformación genética con las construcciones de ADN de la presente invención y reducción de la frecuencia de plantas transformadas con región de vector no T- ADN. En algunas modalidades, la frecuencia de plantas transformadas con región no T-ADN se puede definir como menor que o igual a aproximadamente 20%. En algunas modalidades, la frecuencia es menor que o igual a aproximadamente 15%, en algunas modalidades menor que aproximadamente 10%, y en algunas modalidades menor que o igual a aproximadamente 8% ó 5%. En algunas modalidades de los métodos de la invención, la frecuencia de eventos de transformación de T-ADN de una o dos copias obtenidos es mayor que o igual a aproximadamente 70% ó 75%. En algunos casos, esa frecuencia puede aumentar a mayor que o igual a aproximadamente 80% o 85%, y en algunas modalidades, a mayor que aproximadamente 90% ó 95%. Además de un oriRi de longitud completa, la presente invención abarca vectores de transformación de plantas que contienen mutantes y variantes de oriRi que retienen función sustancialmente similar a la secuencia de longitud completa cuando se usan en la presente invención. Por ejemplo, los solicitantes han identificado la secuencia truncada descpta en SEQ ID NO: 3 que es adecuada para usarse en la presente invención. Un experto en la técnica puede hacer fácilmente cambios, deleciones, substituciones, etc., adicionales en la secuencia de oriRi y determinar selectivamente la actividad funcional usando los métodos de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención abarca dichas variantes y mutantes. Características y ventajas adicionales de la invención se expondrán en parte en la descripción que sigue, y en parte serán obvias de la descripción, o pueden ser aprendidas por la práctica de la invención. Las características y ventajas de la invención serán realizadas y obtenidas por medio de los elementos y combinaciones particularmente indicadas en las reivindicaciones anexas. Cabe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ilustrativas y explicativas únicamente y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. Los dibujos anexos, que se incorporan en, y constituyen parte de esta especificación, ilustran diferentes modalidades de la invención y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica al cual está dirigida esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención aquí es para describir modalidades particulares únicamente y no se pretende que limite la invención. Como se usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones anexas, se pretende que las formas singulares "un," "una," "el" y "la" incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un mapa de plásmido de pMON83856, el vector base con un fragmento oriRi de 5 6 kb usado para la construcción de pMON83882 para transformación de soya y pMON97352 para transformación de maíz La figura 2 muestra un mapa de plásmido de pMON83882, el vector prueba con un fragmento opRi de 5 6 kb y gen marcador de 5-enolp?ruv?lsh?k?mato-3-fosfato sintasa (CP4-EPSPS) seleccionable y el gen uidA (gus) de ínteres, como un ejemplo, para transformación de soya La figura 3 muestra un mapa de plásmido de pMON83934, un vector base con un fragmento oriRi de 4 2 kb usado para la construcción de pMON83937 La figura 4 muestra un mapa de plásmido de pMON83937, un vector prueba con un fragmento opRi de 4 2 kb y gen marcador de CP4 seleccionable y GOI (gus), como un ejemplo, para transformación de soya La figura 5 muestra un mapa de plásmido de pMON97352, un vector prueba con un fragmento opRi de 5 6 kb y gen marcador de CP4 seleccionable y GOI (gus), como un ejemplo, para transformación de maíz La figura 6 muestra un mapa de plásmido de pMON92726 que se uso como un control para transformación de maíz Contiene la misma estructura de gen que pMON97352 excepto por el origen de rephcacion Contiene onV en lugar de opRi La figura 7 muestra un mapa de plásmido de pMON87488, un vector transformación de 2 T-ADN, que se usó como a control para transformación de soya. Contiene or/V en lugar de oriRi. La figura 8 muestra un mapa de plásmido de pMON96001 , un vector prueba de transformación de 2 T-ADN con un fragmento oriRi de 4.3 kb y gen marcador de CP4 seleccionable y GOl (gus), como un ejemplo, para transformación de soya. La figura 9 muestra un mapa de plásmido de pMON96010, un vector prueba de transformación de 2 T-ADN con un fragmento oriRi de 5.6 kb y gen marcador de CP4 seleccionable y GOl (gus), como un ejemplo, para transformación de soya. La figura 10 muestra el efecto de tipo de origen de replicación sobre la frecuencia de transformación en maíz. Las barras de error representan el intervalo de confianza de 95%; * índica una diferencia significativa entre oriRi (pMON97352) y oriV (pMON92726). La figura 11 muestra el efecto de tipo de origen de replicación sobre la transferencia de secuencia de estructura de base en transformación en maíz. Las barras de error representan el intervalo de confianza de 95%; * indica una diferencia significativa entre oriRi (pMON97352) y oriV (pMON92726). oriRi/oriV, RB, y LB indica el tipo de sonda de estructura de base usado. La figura 12 muestra el efecto de tipo de origen de replicación sobre la calidad del transgen en transformación en maíz. Las barras de error representan el intervalo de confianza de 95%. 0, 1 , 2, 3+ indica el número de copias. La figura 13 muestra un mapa de plásmido de pMON96951 que contiene origen de replicación de repABC de plásmido p42v de Rhizobium etli CFN42 y gen marcador de CP4 EPSPS seleccionable para soya.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION La invención se describirá ahora por referencia a modalidades más detalladas, con referencia ocasional a los dibujos anexos. Esta invención, sin embargo, se puede modalizar en diferentes formas y no debe considerarse como limitada a las modalidades expuestas aquí. Más bien, estas modalidades son ilustrativas y se proveen de tal manera que esta descripción sea amplia y completa, y transmita por completo el alcance de la invención a los expertos en la técnica. La presente invención se refiere, en parte, al descubrimiento de que el origen de replícación de repABC, tal como el de Agrobacterium rhizogenes pRi ("oriRi' o "oriPRi'), que mantiene 1-3 copias en bactepas tales como Agrobacterium, se puede usar en vectores de transformación de plantas y puede impartir eventos de transformación altamente deseables. Los vectores de la invención, por ejemplo, pueden reducir significativamente la frecuencia de eventos de transformación que transfieren región no T-ADN, es decir, ADN de estructura de base del vector y, por ejemplo, pueden incrementar significativamente el número de una o dos copias de eventos de transformación de T-ADN, es decir, el gen de interés. La técnica anterior no enseña ni sugiere el uso de oriRi para lograr estos resultados de transformación inesperados. Los vectores y métodos de la invención mejoran los eventos de transformación en la preparación de plantas de cultivo transgénicas. Como se usa aquí, una planta de cultivo transgénico contiene una molécula de polinucleótido exógena o un transgen heterólogo insertado en el genoma de una célula de planta de cultivo. Una célula de planta de cultivo ¡ncluye, sin limitación, una célula vegetal, y además comprende cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, vastagos, gametofitos, esporofitos, óvulos, polen y microsporas, y semillas, y frutos. Por "exógeno" o "heterológo" se entiende una molécula de polinucleótido que se origina desde el exterior de la célula vegetal dentro de la cual la molécula de polinucleótido es introducida. Una molécula de polinucleótido exógena puede tener una secuencia de nucleótídos que ocurren naturalmente o que no ocurren naturalmente. Un experto en la técnica entiende que una molécula de polinucleótido exógena puede ser una molécula heteróloga derivada de una especie diferente de cualquier otro organismo o la especie vegetal distinta a la planta en la cual la molécula de polinucleótido es introducida o puede ser una molécula de polinucleótído derivada de la misma especie vegetal que la planta en la cual es introducida. El polinucleótido exógeno (transgen heterólogo) cuando se expresa en una célula vegetal transformada provee un rasgo agronómico a la célula o a una planta transformada derivada de la célula. Estos genes de interés (GOl) proveen rasgos agronómicos benéficos a plantas de cultivo, por ejemplo, ¡ncluyendo, pero sin limitarse a elementos genéticos que comprenden resistencia a herbicidas (patente de E.U.A. No. 5,633,435; patente de E.U.A. No. 5,463,175), rendimiento incrementado (patente de E.U.A. No. 5,716,837), control de insectos (patente de E.U.A. No. 6,063,597; patente de E.U.A. No. 6,063,756; patente de E.U.A. No. 6,093,695; patente de E.U.A. No. 5,942,664; patente de E.U.A. No. 6,110,464), resistencia a enfermedades por hongos (patente de E.U.A. No. 5,516,671 ; patente de E.U.A. No. 5,773,696; patente de E.U.A. No. 6,121 ,436; y patente de E.U.A. No. 6,316,407; y patente de E.U.A. No. 6,506,962), resistencia a virus (patente de E.U.A. No. 5,304,730 y patente de E.U.A. No. 6,013,864), resistencia a nematodos (patente de E.U.A. No. 6,228,992), resistencia a enfermedades bacterianas (patente de E.U.A. No. 5,516,671 ), producción de almidón (patente de E.U.A. No. 5,750,876 y patente de E.U.A. No. 6,476,295), producción de aceites modificados (patente de E.U.A. No. 6,444,876), producción de aceite alta (patente de E.U.A. No. 5,608,149 y patente de E.U.A. No. 6,476,295), contenido de ácidos grasos modificado (patente de E.U.A. No. 6,537,750), producción de proteína alta (patente de E.U.A. No. 6,380,466), maduración de frutos (patente de E.U.A. No. 5,512,466), nutrición animal y humana incrementada (patente de E.U.A. No. 5,985,605 y patente de E.U.A. No. 6,171 ,640), biopolímeros (patente de E.U.A. No. 5,958, 745 y publicación de patente de E.U.A. 2003/0028917), resistencia el estrés ambiental (patente de E.U.A. No. 6,072,103), péptídos farmacéuticos (patente de E.U.A. No. 6,080,560), rasgos de procesamiento mejorados (patente de E.U.A. No. 6,476,295), capacidad de digestión mejorada (patente de E.U.A. No. 6,531 ,648), rafinosa baja (patente de E.U.A. No. 6,166,292), producción de enzima industrial (patente de E.U.A. No. 5,543,576), sabor mejorado (patente de E.U.A. No. 6,011 ,199), fijación de nitrógeno (patente de E.U.A. No. 5,229,114), producción de semilla híbrida (patente de E.U.A. No. 5,689,041 ), y producción de biocombustíble (patente de E.U.A. No. 5,998,700), los elementos genéticos y transgenes descritos en las patentes listadas anteriormente se incorporan aquí por referencia. La presente invención provee construcciones de ADN recombinante vegetales para producir plantas de cultivo transgénicas. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para preparar la construcción de ADN recombinante de plantas de cultivo de la presente invención. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al. (1989). Moléculas de polmucleótidos exógenas creadas por los métodos pueden ser transferidas a una célula de planta de cultivo por una bacteria transformante de plantas tal como Agrobacterium o por otros métodos conocidos por los expertos en la técnica de transformación de plantas. La transferencia de genes a plantas se ha mostrado usando diversas especies de bacterias como se describe en Broothaerts ef al. (2005) y la solicitud provisional de E.U.A. 60800872, incorporadas aquí por referencia. Las construcciones recombinantes de ADN de la presente invención se pueden transferir a una célula de planta de cultivo por transformación usando Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp., Mesorhizobium loti, o cualquier otra bacteria capaz de transformar una célula vegetal. La invención incluye vectores de transformación de plantas para usarse en transformación de plantas mediada por Agrobacterium. Los vectores de la presente invención son generalmente plásmidos, pero el origen de replicación de oriRi puede ser reemplazado por otros orígenes de replicación de la familia repABC para mantener muy bajo el número de copias (1-3 copias por célula) en Agrobacterium. También, los vectores sin un origen de replicación de mantenimiento de Agrobacterium son capaces de mantenerse a sí mismas en Agrobacterium con secuencias en el T-ADN que se puede integrar ya sea en plásmido Ti en A. tumefaciens, plásmido Ri ie A. rhizogenes o cromosoma de Agrobacterium a través de recombinación homologa. Esto da por resultado el mismo efecto de una reducción en inserción de secuencia no T-ADN y un incremento en eventos de transformación de números de copias bajos, ya que el cromosoma, plásmído Ti o Ri está presente en una sola copia. Cuando se usan especies de Rhizobia o no Agrobacterium se usan para transformación de plantas, T-ADN que contiene GOl puede ser integrado en el cromosoma o en plásmidos repABC en las bacterias hospedero, que pueden producir el mismo efecto como lo hace Agrobacterium. Un vector la presente invención puede comprender por lo menos uno de región de borde derecho o de borde izquierdo de plásmido Ti de Agrobacterium. Los vectores pueden comprender por lo menos un par de bordes. Los vectores pueden incluir cuatro pares de bordes, pero el vector a menudo comprende uno o dos pares. Los vectores de la presente invención pueden comprender además una región codificadora para un marcador seleccionable para el mantenimiento en hospederos bacterianos. Las regiones codificadoras para marcadores seleccionables incluyen Spec/Strp que codifica para Tn7 aminoglicósido adeniltransferasa (aadA) que confiere resistencia a espectínomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Otros genes de resistencia incluyen genes de resistencia a carbenecilína, ampicilina, y kanamicina. Otros son conocidos y pueden se usados fácilmente en la presente invención por los expertos en la técnica. Los vectores de la presente invención también pueden comprender una región codificadora para un gen marcador seleccionable de plantas, que está típicamente localizado en T-ADN, para seleccionar células vegetales transformadas con el reactivo correspondiente. El marcador seleccionable de plantas puede proveer resistencia a un compuesto de selección positivo, por ejemplo, resistencia a antibióticos (v.gr., kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, etc.), o resistencia a herbicidas (v.gr., incluyendo pero sin limitarse a: glifosato, Dícamba, glufosinato, sulfonilureas, imidazolinonas, bromoxinil, dalapon, ciclohexanodiona, inhibidores de protoporfirínogen oxidasa, y de isoxaflutol). Las moléculas de polinucleótido que codifican proteínas implicadas en tolerancia a herbicidas se conocen en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a una molécula de polinucleótido que codifica a) tolerancia a un glifosato incluyen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasas (EPSPS; patente de E.U.A. 5,627,061 , patente de E.U.A. 5,633,435, patente de E.U.A. 6,040,497, patente de E.U.A. 5,094,945, WO04074443, y WO04009761 ), glifosato oxidoreductasa (GOX; patente de E.U.A. 5,463,175), glifosato descarboxilasa (WO05003362 y solicitud de patente de E.U.A. 20040177399), y glifosato-N-acetil transferasa (GAT; publicación de patente de E.U.A. 20030083480) que confiere tolerancia a glifosato; b) dicamba monooxigenasa (DMO, codificada por ddmC) que confiere tolerancia a herbicidas similares a auxina tales como dicamba (solicitudes de patente de E.U.A. 20030115626, 20030135879; Hermán ef al., 2005); c) fosfinotrícina acetiltransferasa (bar) que confiere tolerancia a fosfinotricina o glufosínato (U.S. 5,646,024, U.S. 5,561 ,236, EP 275,957; U.S. 5,276,268; U.S. 5,637, 489; U.S. 5,273, 894); d) ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa que confiere tolerancia a ácido 2,2-dicloropropiónico (Dalapon) (W099271 16); e) acetohidroxiácido sintasa o acetolactato sintasa que confiere tolerancia a inhibidores de acetolactato sintasa tales como sulfonilurea, ¡midazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxíbenzoatos y ftalída (U.S. 6,225,105; U.S. 5,767,366, U.S. 4,761 ,373; U.S. 5,633,437; U.S. 6,613,963; U.S. 5,013,659; U.S. 5,141 ,870; U.S. 5,378,824; U.S. 5,605,011 ); f) halogenoarilnitrilasa (Bxn) para conferir tolerancia a bromoxinil (WO8704181A1 ; U.S. 4,810,648; WO8900193A); g) acetil-coenzima A carboxilasa modificada para conferir tolerancia a ciclohexanediona (setoxidim) y ariloxífenoxípropíonato (haloxifop) (U.S. 6,414,222); h) dihidropteroato síntasa (sul\) para conferir tolerancia a herbicidas de sulfonamida (U.S. 5,597,717; U.S. 5,633,444; U.S. 5,719,046); i) polipéptido de fotosistema II de 32 kD (psbA) para conferir tolerancia a herbicidas de triazina (Hirschberg et al., 1983); j) antranilato sintasa para conferir tolerancia a 5-metiltriptofano (U.S. 4,581 ,847); k) ácido dihidrodipicolínico sintasa (dapA) para conferir tolerancia a aminoetil cisteína (W08911789); I), fitoeno desaturasa (crfl) para conferir tolerancia a herbicidas de piridazinona tales como norflurazon (JP06343473); m) hidroxi-fenil piruvato dioxogenasa para conferir tolerancia a herbicidas de ciclopropilisoxazol tales como ¡soxaflutol (WO 9638567; U.S. 6,268,549); n) protoporfirinogen oxidase I modificada (protox) para conferir tolerancia a inhibidores de protoporfirinogen oxidasa (U.S. 5,939,602); y o) ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1 ) para conferir tolerancia a un herbicida que contiene una porción ariloxialcanoato (WO05107437). Ejemplos de dichos herbicidas incluyen fenoxi auxinas (tales como 2,4-D y diclorprop), pirídiloxi auxinas (tales como fluroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP), inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (tales como haloxifop, quizalofop, y diclofop), e inhibidores de fenoxiacetato protoporfirinogen oxidasa IX 5-sustituidos (tales como piraflufen y flumiclorac).

Además de un marcador seleccionable de plantas, en algunas modalidades puede ser deseable usar un gen reportero. En algunos casos, un gen reportero se puede usar con o sin un marcador seleccionable. Los genes reporteros son genes que típicamente no están presentes en el organismo o tejido receptor y típicamente codifican para proteínas que dan por resultado algún cambio fenotípico o propiedad enzimática. Ejemplos de dichos genes se proveen en Wising ef al. (1988), que se incorpora aquí por referencia. Los genes reporteros preferidos incluyen la beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli, el gen de cloranfenícol acetil transferasa de Tn9 de E. coli, la proteína fluorescente verde de la medusa bíoluminescente Aequorea victoria, y los genes de luciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis. Una prueba para detectar expresión de gen reportero se puede realizar en un tiempo adecuado después de que dicho gen ha sido introducido en células receptoras. Una preferida de dichas pruebas incluye el uso del gen que codifica beta-glucuronidasa (GUS) del locus uidA de E. coli como lo describe Jefferson et al. (1987) para identificar células transformadas, referidas aquí como GUS. En algunas modalidades, los vectores de la presente invención comprenden un origen de replicación para mantenimiento en E. coli. Estos orígenes de replicación se pueden derivar, por ejemplo, de pBR322 o de pUC. Un ejemplo de dicho origen de replicacíón es ColE . Los vectores de la presente invención pueden incluir cualquier origen de replicación que mantenga por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100 o más copias de plásmido en E. coli. En algunas modalidades, el ori mantiene un número de copias alto en E. coli (v.gr.,, mayor que 5, 10, 15, 20, 25 ó 30, y en algunas modalidades adicionales, mayor que 10, 15, 20, 25 ó 30). Dichos vectores de número de copias alto hacen más fácil amplificar la cantidad de ADN disponible para transformación. Por lo tanto, en algunas modalidades, la presente invención ¡ncluye un vector que contiene un ori que provee números de copias altos en células de E. coli, y un segundo ori, tal como un ori que pertenece a la familia repABC, por ejemplo, oriRi, que mantiene número de copias extremadamente bajo, por ejemplo 1-3, en Agrobacterium. Los vectores de la presente invención también comprende por lo menos un segmento de ADN, que comprende elementos cis y/o trans, que es necesario y suficiente para mantenimiento de plásmido de copias bajas (1-3 copias) en una bacteria transformante de plantas tal como Agrobacterium. Por lo menos un segmento de ADN preferiblemente comprende un origen de replicación de la familia repABC. Además, por lo menos un segmento de ADN puede incluir un origen de replicación de plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes (oriRi) y/u origen de repABC de plásmido p42b de Rhizobium etli. Además, la familia repABC preferiblemente comprende genes de replicación repA, repB y repC. Por lo menos un segmento también puede comprender secuencias de región intergénicas, igsl e igs2. Además, por lo menos un segmento de ADN puede incluir un palíndroma de 16-pb después de repC. Como se usa aquí, "el origen de replicación" de un plásmido "repABC", es decir, un plásmido que utiliza dichas secuencias para replicación y división en una célula, se puede definir como que comprende repA (v.gr., SEQ ID NO:32 de pRi de A. rhizogenes', SEQ ID NO:38 de p42b de R. etli), repB (v.gr., SEQ ID NO: SEQ ID NO:33 de A. rhizogenes; SEQ ID NO:39 de p42b de R. etli), repC (v.gr., SEQ ID NO: SEQ ID NO:34 de A. rhizogenes; SEQ ID NO:40 de p42b de R. ef//),igs1 (v.gr., SEQ ID NO:35 de A. rhizogenes; SEQ ID NO:41 de p42b de R. etli)), igs2 (v.gr., SEQ ID NO:36 de A. rhizogenes; SEQ ID NO:42 de p42b de R. etli), y opcionalmente puede comprender una secuencia palindrómíca (v.gr., SEQ ID NO:37). En otras modalidades, el origen de replicación puede comprende aquellas secuencias requeridas para mantener un número de copias bajo (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 3 copias) dentro de una célula bacteriana transformante de células vegetales. Ejemplos de dichos origen es de repABC de se encuentran en SEQ ID NOs: 1-4, en el oriRi del Ri plásmido de A. rhizogenes, y en el plásmido p42b de R. etli, entre otros. En una modalidad, por lo menos un segmento es como se identifica en SEQ ID NO:1. En otras modalidades, por lo menos un segmento consiste esencialmente de la siguiente secuencia: 5618 pb oriRi de pMON83882 bases (633-6250) identificada como SEQ ID NO:2. En otra modalidad, por lo menos un segmento comprende y/o consiste esencialmente de la secuencia identificada en SEQ ID NO:3. En otra modalidad más, por lo menos un segmento puede ser repABC de p42b de R. etli como se identifica en SEQ ID NO:4. Dentro de la definición de cualquiera de la secuencia de ácido nucleico o polipéptido definida aquí se incluyen secuencias que presentan un grado especificado de identidad a dichas secuencias. Por ejemplo, cabe notar que aunque aquí se exponen secuencias de ácido nucleico específicas, se pueden hacer modificaciones a las secuencias descritas sin apartarse del alcance de la invención. En particular, secuencias de ácidos nucleicos que son sustancíalmente idénticas a las expuestas aquí se pueden usar con la presente invención. Una primera secuencia de ácido nucleico despliega "identidad sustancial" a una secuencia de ácido nucleico de referencia si, cuando se alinea de manera óptima (con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas dan un total menor que 20 por ciento de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación) con el otro ácido nucleico (o o su cadena complementaria), hay por lo menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia de nucleótido, preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% de identidad, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88% o 89% de identidad, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad sobre una ventana de comparación de por lo menos 200 posiciones de nucleótidos, preferiblemente por lo menos 300 posiciones de nucleótidos, muy preferiblemente por lo menos 400 posiciones de nucleótidos, y muy preferiblemente aún sobre la longitud entera del primer ácido nucleico. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede conducir por el método de similitud de Pearson y Lipman (1988); preferiblemente por implementaciones computarízadas de estos algoritmos en el paquete de software Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wl. El ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud completa o una porción de una molécula más larga. Alternativamente, dos ácidos nucleicos tienen identidad sustancial si uno hibrida al otro bajo condiciones de hibridación astringentes. El término "condiciones de hibridación astringentes" se define como condiciones bajo las cuales una secuencia de prueba hibrida específicamente con una secuencia(s) objetivo pero no con secuencias no objetivo, como se puede determinar empíricamente. El término "condiciones astringentes" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico objetivo (es decir, a una secuencia de ácido nucleico particular de interés) por el procedimiento de hibridación específica (véase por ejemplo Sambrook ef al., 1989, a 9.52-9.55, Sambrook ef al. , 1989 a 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, 1984; y Wetmur y Davídson, 1968). Las condiciones astringentes apropiadas para hibridación de ADN son, por ejemplo, 6.0x cloruro de sodio/cítrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de 0.2x SSC a 50°C. Los detalles de dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica o se pueden encontrar en manuales de laboratorio ¡ncluyendo pero sin limitarse a Current Protocols in Molecular Biology (1989). En algunas modalidades, las condiciones de astringencia inferiores se pueden usar cambiando el lavado a aproximadamente 2.0x SSC a 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado se puede incrementar desde condiciones de astringencia bajas a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, hasta condiciones de astringencia más altas a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal se pueden variar, o bien la temperatura o la concentración de sal se puede mantener constante mientras la otra variable se cambia. Por ejemplo, la hibridación usando sondas o iniciadores de ADN o ARN se puede realizar a 65°C en 6x SSC, 0.5% SDS, 5x Denhardt's, 100 µg/ml de ADN no específico (v.gr., ADN de esperma de salmón sonicado) lavando a 0.5x SSC, 0.5% SDS a 65°C, para alta astringencia. Se dice que una molécula de ácido nucleico ha de ser el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presentan complementariedad completa. Como se usa aquí, se dice que las moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementaria a un nucleótído de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar una a otra con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan templadas una a otra por lo menos bajo condiciones de "astringencia baja" convencionales. De manera similar, se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden híbridar una a otra con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan templadas una a otra bajo condiciones de "astringencia alta" convencionales. Se contempla que las condiciones de hibridación bajo astringencia más baja tal como temperaturas de hibridación y/o lavado más bajas se pueden usar para identificar secuencias relacionadas que tengan un grado más bajo de similitud de secuencia si la especificidad de unión de la sonda o iniciador a la secuenc?a(s) objetivo se conserva Por consiguiente, las secuencias de nucleótido de la presente invención se pueden usar por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con estiramientos complementarios de fragmentos de ADN La detección de segmentos de ADN por hibridación es bien conocida por los expertos en la técnica, y por lo tanto depende de la aplicación contemplada, se desearía utilizar condiciones de hibridación variables para lograr grados variables de selectividad de sonda hacia la secuencia objetivo y el método de elección dependerá de los resultados deseados Condiciones de astringencia convencionales se describen en Sambrook, et al (1989) y en Haymes et al (1985) La construcción de ADN de la presente invención se puede introducir en el genoma de una planta hospedero deseada por un método de transformación de plantas mediada por Agrobacterium adecuado Los métodos para transformar plantas mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens incluyen Fraley et al , (1985), y Rogers ef al , (1987) La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens se logra a través del uso de una bacteria del suelo genéticamente manipulada que pertenece al género Agrobacterium Vanas especies de Agrobacterium son mediadoras de la transferencia de un ADN específico conocido como "T-ADN," que pueden ser genéticamente manipulado para portar cualquier pieza deseada de ADN en muchas especies de plantas Los principales eventos que marcan el proceso de patogénesis mediada por T-ADN son la inducción de genes de virulencia, y procesamiento y transferencia de la cadena T. Este proceso es el tema de muchas revisiones (Ream, 1989; Howard y Citovsky, 1990; Kado, 1991 ; Winans, 1992; Zambryski, 1992; Gelvin, 1993; Binns y Howitz, 1994; Hooykaas y Beijersbergen, 1994; Lessl y Lanka, 1994; Zupan y Zambryski, 1995). Especies que nos son Agrobacterium tales como Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp., Mesorhizobium loti, también se pueden usar para transferir genes usando las construcciones de ADN de la presente invención (Broothaerts et al., 2005 y la solicitud provisional de E.U.A. 60/800,872, incorporada aquí por referencia). Otros métodos para introducir ADN en células también se pueden usar. Estos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir métodos químicos y métodos físicos tales como microinyección, electroporación y bombardeo de micro-proyectiles. Las técnicas de regeneración de células vegetales se basan en la manipulación de ciertas fítohormonas en un medio de cultivo de tejido, también se basan típicamente en un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido junto con las secuencias de nucleótido deseadas. La elección de la metodología con protocolos adecuados que están disponibles para hospederos de Leguminosae (alfalfa, soya, trébol, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, perejil), Cruciferae (col, rábano, canola/semilla de colza, etc.), Cucurbitaceae (melones y pepino), Gramineae (trigo, cebada, arroz, maíz, etc.), Solanaceae (papa, tabaco, tomate, pimientos), varios cultivos florales, tales como girasol, y árboles que producen nueces, tales como almendras, anacardos, nueces y pacanas. Véase, por ejemplo, Ammirato et al. (1984); Shímamoto ef al. (1989); Fromm (1990); Vasil ef a/., (1990); Vasil et al. (1992); Hayashimoto (1990); y Datta ef al. (1990). Dichas tónicas de regeneración se describen generalmente en Klee ef al. (1987). Los métodos y composiciones para transformar plantas al introducir una construcción de ADN transgénico en el genoma de una planta en la práctica de esta invención puede incluir cualquiera de los métodos bien conocidos y demostrados. Por ejemplo, la transformación mediada por Agrobacterium como se ilustra en las patentes de E.U.A. Nos. 5,824,877; 5,591 ,616; y 6,384,301 , todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Las plantas que se pueden hacer mediante la práctica de la presente invención incluyen cualesquiera plantas que están sujetas a transformación y regeneración e incluyen, pero no se limitan a, Acacia, alfalfa, eneldo, manzana, chabacano, alcachofa, arugula, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijol, remolacha, zarzamora, arándano azul, brócoli, colecitas de bruselas, col, cañóla, melón, zanahoria, mandioca, coliflor, apio, col china, cereza, cilantro, citrus, clementinas, café, maíz, algodón, pepino, abeto Douglas, berenjena, endibía, escarola, eucalipto, hinojo, higos, árboles forestales, calabacín, uva, toronja, ligamaza, jicama, kiwí, lechuga, puerros, limón, lima, pino de incienso, mango, melón, champiñones, nuez, avena, quimbombó, cebolla, naranja, planta e ornato, papaya, perejil, guisante, durazno, cacahuate, pera, pimiento, placaminero, pino, pina, plátano, ciruela, granada, álamo temblón, papa, calabaza, membrillo, pino radiado, radicchio, rábano, grosella, arroz, centeno, sorgo, pino sureño, soya, espinaca, calabaza amarilla, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, batata, liquidámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, turba, vid, sandía, trigo, camotes, y calabacita zucchiní. En modalidades preferidas, la planta es una planta de soya, maíz, cañóla o algodón. En modalidades particulares, la planta es una planta de maíz. En modalidades particulares, la planta es una planta de soya. En otras modalidades, la planta es una planta de algodón. Y en modalidades adicionales, la planta es una planta de cañóla. Los métodos de la presente dan eficiencias de transformación mejoradas, reduciendo significativamente la frecuencia de plantas transformadas con ADN de estructura de base del vector, o "no-T ADN." En algunas modalidades, la frecuencia de plantas transformadas con no-T ADN es menor que o igual a aproximadamente 20%. En algunas modalidades, la frecuencia de plantas transformadas con no-T ADN es menor que o igual a aproximadamente 15%, o menor que ¡gual a aproximadamente 10%, o menor que o igual a aproximadamente 8% ó 5%. Además, los métodos de la invención dan eventos de transformación de T-ADN de una o dos copias muy altos. Por ejemplo, en algunas modalidades, la frecuencia de eventos de transformación de T-ADN de una o dos copias es mayor que o igual a aproximadamente 70% ó 75%, como se mide usando Southern blotting. En algunas modalidades, esa frecuencia es mayor que o igual a aproximadamente 80% ó 85%, y en algunos casos, 90% ó 95%, como se mide con Southern blotting.

En algunas modalidades, la frecuencia de plantas transformadas con una región de vector de no-T ADN es aproximadamente 50%, 40%, 20%, 15%, o 10% menor que la frecuencia de T-ADN encontrado en la misma variedad de planta que ha sido transformada con un vector de transformación de plantas que no contiene el elemento repABC tal como elemento oriRi de la presente invención. En otras modalidades, la frecuencia de eventos de transformación de T-AND de una o dos copias es de aproximadamente 50%, 40%, 20%, 15%, o 10% mayor que la frecuencia de eventos de transformación de T-ADN de una o dos copias en relación con la misma variedad de planta transformada con vector de transformación de plantas que no contiene el elemento repABC tal como elemento oriRi de la presente invención. Por lo tanto, ciertas modalidades de la presente invención proveen métodos que implican el uso del elemento repABC tal como oriRi de Agrobacterium rhizogenes y origen de repABC del plásmido p42b de Rhizobium etli, incluyendo las secuencias expuestas aquí, para reducir la frecuencia de plantas transformadas con región de vector de no-T-ADN. La presente invención también está dirigida al uso del elemento repABC tal como oriRi de Agrobacterium rhizogenes y origen repABC del plásmido p42b de Rhizobium etli, incluyendo las secuencias expuestas aquí, para incrementar la frecuencia de eventos de transformación de T-ADN de una o dos copias. En algunas modalidades, ambos métodos se utilizan en combinación para lograr eventos de transformación que tienen frecuencias más bajas de incorporación de estructura de base y frecuencias más altas de eventos de transformación de T-ADN de una o dos copias.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proveen para dilucidar mejor la práctica de la presente invención y no deben interpretarse de ninguna manera para limitar el alcance de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que varias modificaciones, adiciones, sustituciones, truncamientos, etc., se pueden hacer a los métodos y genes descritos aquí mientras no se aparten del alcance y espíritu de la presente invención.

EJEMPLO 1 Preparación de vectores Los pasos de clonación siguieron protocolos estándares descritos por Sambrook ef al. (1989). El fragmento oriRi de 5.6 kb, cortado de pCGN1589 con digestión por Dral, se usó para remplazar el fragmento oriV de pMON67438 que fue digerido con PshAI y BstXI y rasurado con T4 ADN polimerasa. Esto dio por resultado un vector de base oriRi pMON83856 (figura 1 ). El vector de prueba oriRi de 5.6 kb pMON83882 (figura 2) se hizo mediante la inserción de fragmentos gus y CP4 del vector de control de oriV pMON67438, secuencialmente digerido con Accl (blunted)/BamHI, en pMON83856 que había sido abierto con Pmel/BamHI. Para truncar el fragmento oriRi, dos iniciadores, 5' CACGTGTACAAGGTAGAATCCGCCTGAG 3' (promotor oriRi 5' hacia el extremo 5'; SEQ ID NO:5) y 5' GTATACAGGCTCTCCTTCACGATCAAC 3' (oriRi 3' después de repC: SEQ ID NO:6), se sintetizaron y se realizó PCR con pfu polimerasa de alta fidelidad y pMON83856 como una plantilla. El producto de PCR se purificó y se insertó en pMON83930, que fue digerido con Afel y Xhol y rasurado con T4 ADN polimerasa, para remplazar el fragmento oriV. El vector pMON83934 resultante (figura 3), con el oriRi truncado, fue después confirmado por secuenciación de ADN. Para hacer el vector de prueba pMON83937 (figura 4) con un oriRi truncado, pMON83934 se abrió con Kpnl, se rasuró con T4 ADN polimerasa, y fue seguido por digestión con BamHl; el fragmento gus y Cp4 del vector de control oriV pMON67438 fue secuencialmente digerido con Accl, llenado con T4 ADN polimerasa, y después digerido con BamHl. Los dos fragmentos se ligaron con T4 ADN ligasa y dieron por resultado pMON83937. Para construir el vector de transformación pMON97352 (figura 5), una secuencia de enlazador que contenía sitios Spel y PspOMI se sintetizó templando dos oligos 5'-AGCTTGGGCCCCTCGAGGCTAGCACTAGTG-3' (SEQ ID NO:7 y 5'-GATCCACTAGTGCTAGCCTCGAGGGGCCCA-3' (SEQ ID NO: 8), y se insertó en pMON83856 con digestión por BamHl y Híndlll. El vector oriRi intermediario resultante se abrió con Spel y PspOMI y se ligó con los cassettes de expresión CP4 y gus cortados de pMON92726 (figura 6) con digestión por Notl y Spel (véase figura 5, pMON97352). El vector progenitor oriV pMON992726 se usó como un vector de control para comparar con el vector de prueba de oriRi óe maíz pMON97352. Para construir el vector de control de oriV 2T pMON87488 (figura 7), el borde derecho de octopine se cortó de pMON51676, se rasuró con T4 ADN polimerasa y se insertó en pMON87485 que se abrió con Sall/Spel, llenado con T4 ADN polimerasa y tratado con CIP. Para hacer los vectores de oriRi 2T, pMON96001 (figura 8) y pMON96010 (figura 9), el oriV en pMON87488 se removió con Afel y Xhol, el vector se llenó con T4 ADN polimerasa y se insertó con el replicón oriRi de 4.2 kb de pMON83934 obtenido al digerir pMON83934 con Pmll y BstZ17l, dando por resultado PMON96001. El replicón oriRi de 5.6 kb de pCGN1589 obtenido al digerirlo con digestión por Dral se insertó para dar pMON96010.

EJEMPLO 2 Transformación de cultivo de soya La transformación de células de soya y regeneración de células en plantas fértiles intactas por transformación mediada por Agrobacterium se puede conducir usando varios métodos conocidos en la técnica. Un método para transformación de soya (v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 6,384,301 y 7,002,058) se utilizó con un proceso de organogénesis. Las construcciones de ADN descritas en la presente invención (v.gr., plásmido pMON83882, sustancialmente como se muestra en la figura 2, y plásmido pMON83937, sustancíalmente como se muestra en la figura 4) se transforman en una cepa ABI de Agrobacterium desarmada. Los dos vectores de control oriV, pMON67438 y pMON83898 (el mismo GOl pero en diferentes orientaciones), fueron también transferidos a células de Agrobacterium. Dos construcciones T ADN y controles respectivos como se describió antes también se usaron para transformar soya. La construcción de ADN fue transferida a Agrobacterium por electroporación. Colonias individuales fueron recuperadas en el medio LB con espectínomicína 50 mg/l (para vectores oriRi) o 75 mg/l (para vectores oriV) y kanamicina 50 mg/l e inoculados en 20-50 ml de medio LB líquido con la misma selección en un agitador con 200 rpm. El plásmido en Agrobacterium fue verificado por digestión con enzima de restricción de plásmido minipreparado de 10 ml de cultivo. El resto del cultivo líquido se mezcló con glicerol a una concentración final de 20%, se puso en alícuotas y se almacenó a -80 C como cultivos de semilla. Para preparar el inoculo de Agrobacterium para transformación, 0.25-1 ml de cultivo de semilla congelada se inoculó en 250 ó 500 ml en medio LB con una selección de antibiótico como se mencionó antes y se hizo crecer durante la noche a 26°C-28°C con agitación a 200 rpm a una fase de crecimiento mid-log. El cultivo se hizo girar descendentemente y se suspendió directamente en un medio de inoculación (medio INO) a una concentración de OD66o aproximadamente 0.3, como se midió en un espectrofotómetro. Se uso cultivar de soya A3525 para transformación mediada por Agrobacterium como se describe (v.gr., patente de E.U.A. 7,002,058). Las semillas de soya se hicieron germinar durante menos de 14 horas a temperatura ambiente en un medio de BGM y los explantes de meristemo de semillas maduras de soya se cortaron con máquina como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. 20050005321. Para sonicación por lotes, aproximadamente 100 explantes en tapa de PLANTCON se mezclaron con 20 ml de la suspensión de Agrobacterium en medio INO y se sónico en un sonicador W- 13 durante 20 segundos. Para sonicación en volumen, aproximadamente 1000 explantes en tapa plantcon se mezclaron con 100 ml de suspensión de Agrobacterium en un medio INO y se sonicaron durante 20 segundos. Después de la sonicación, los explantes fueron co-cultivados en el mismo PLANTCON durante 2-4 días a 23°C con un periodo de luz/oscuridad de 16/8 horas. Después los explantes fueron transferidos sobre la superficie del medio de selección WPM con 75 µM de glífosato. Cada PLANTCON contenía aproximadamente 50 explantes. Después de 2 semanas, los explantes fueron transferidos nuevamente a un medio WPM sólido con 75 uM de glifosato con radículas primarias insertadas en el medio, cada PLANTCON contenía aproximadamente 25 explantes. Los vastagos con trifolios completamente expandidos recuperados después de 6-10 semanas de post-inoculación fueron enraizados en un medio BRM con lAA 0.1 mg/l y selección de 25 µM de glifosato. Las plántulas enraizadas fueron transferidas a un invernadero para madurez. Varios medios usados para transformación de soya se detallan más adelante en el cuadro 1.

Los métodos de transformación y regeneración anteriores proveen plantas que son reducidas en gran medida al presentarse ADN de estructura de base de vector. Además, las plantas tienen un benéfico agregado de tener un número de copias reducido en el T-AND de inserto. Las plantas producidas por el método son un aspecto de la invención.

CUADRO 1 Componentes de medio para transformación de soya Otras células de plantas dicotiledóneas pueden ser transformadas y regeneradas en plantas intactas por métodos conocidos en la técnica de transformación de plantas y cultivo de tejido. El uso de métodos mediados por Agrobacterium para transferir T-ADN de los plásmidos de la presente invención son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, algodón (patentes de E.U.A. Nos. 5,004,863; 5,159,135; 5,518,908, 5,846,797, y 6,624,344, incorporadas aquí por referencia) y Brassica (patente de E.U.A. No. 5,750,871 ).

EJEMPLO 3 Tranformación de cultivo de maíz Dos vectores, pMON97352 (oriRi, una sola copia en Agrobacterium) y pMON92726 {oriV, copias múltiples en Agrobacterium como un control) que contenían los mismos cassettes de gen CP4 y gus del gen marcador seleccionable de plantas, ambos activados por promotores de actina de arroz (figura 5), fueron electroporados en una cepa ABI de Agrobacterium tumefaciens para transformación de maíz. Agrobacterium que contenía el vector en abastecimiento de glicerol se sembró por estrías sobre el medio LB sólido complementado con antibióticos (todos en ingrediente activo) kanamicina (40 mg/l), espectinomicina (31 mg/l), estreptomicina (38 mg/l) y cloramfenicol (25 mg/l) y se incubaron a 28°C durante 2 días. Dos días antes de la inoculación de Agrobacterium de embriones inmaduros de maíz, una colonia de un aza pequeña de Agrobacterium de la placa de Agrobacterium se recogió y se inoculó en 25 ml de medio LB líquido complementado con 62 mg/l de espectinomícina y 40 mg/l de kanamícina en un matraz de 250 ml. El matraz se colocó en un agitador aproximadamente a 150-200 rpm y 27-28°C durante la noche. El cultivo de Agrobacterium después se diluyó (1 a 5) en el mismo medio líquido y se regresó al agitador. Varias horas más tarde, un día antes de la inoculación, las células de Agrobacterium se hicieron girar a 3500 rpm durante 15 mín. La pastilla de células bacterianas se resuspendió en caldo de inducción 200 µM de acetosiringona y 50 mg/l de espectinomicina y 25 mg/l de kanamicína y la densidad de células se ajustó a 0.2 a DO660- El cultivo de células bacterianas (50 ml en cada matraz de 250 ml) se regresó después al agitador y se hizo crecer durante la noche, en la mañana del día de la inoculación, las células bacterianas se hicieron girar y se lavaron con medio 1/2 MS VI líquido (cuadro 2) complementado con 200 µM de acetosiringona. Después de un o más centrifugaciones, la pastilla de células bacterianas se resuspendió en medio 1/2 MS PL (cuadro 2) con 200 µM de acetosiringona (cuadro 2) y la densidad de células se ajustó a 1.0 a DO660 para inoculación. Los reactivos están comercíalmente disponibles y se pueden comprar de un número de proveedores (véase, por ejemplo Sigma Chemical Co., St. Louís, Mo).

CUADRO 2 Medio usados en el ejemplo 3 Línea LH244 de maíz (patente de E.U.A. No. 6,252,148) se usó en este estudio. Mazorcas que contenían embriones inmaduros se cosecharon y se mantuvieron refrigeradas a 4°C hasta usarse. Los embriones inmaduros se aislaron de las mazorcas esterilizadas en la superficie y se dejaron caer directamente en la suspensión de células de Agrobacterium preparada en un tubo de microcentrífuga y se inocularon durante 5 a 20 minutos Después de que la suspensión de células de Agrobacterium se removió usando una pipeta de transferencia estéril de punta fina, los embriones inmaduros fueron transferidos al medio de co-cultivo (cuadro 2). Los embriones se cultivaron en una incubadora en la oscuridad (23°C) durante aproximadamente 24 horas. Después del co-cultivo, los embriones fueron transferidos a un medio MS modificado (MS de inducción, cuadro 2) complementado con 500 mg/l de carbenicilina y 0.1 mM de glifosato a 30°C durante 2 semanas seguido por una semana adicional en un cuarto de cultivo en la oscuridad a 27-28°C. Todos las piezas de callo fueron después transferidas individualmente al primer medio de regeneración, el mismo medio mencionado anteriormente excepto 2,4-D y picloram fueron reemplazados por 3.5 mg/l de BAP (MS/6BA, cuadro 2) y el nivel de carbenícilina se redujo a 250 mg/l. Los cultivos fueron pasados a un cuarto de cultivo con un fotoperiodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad y a 27°C. Después de 5-7 días, las piezas de callo fueron transferidas al segundo medio de regeneración (MSOD, cuadro 2). En otras 2 semanas, las piezas de callo que tenían vastagos regenerados fueron transferidas al mismo medio libre de hormonas en Phytatrays™ para crecimiento posterior. Plantas regeneradas (RO) con una o más raices sanas fueron pasados al suelo en macetas con turba en una cámara de crecimiento. En 7 a 10 días, fueron transplantadas a macetas de 30 cm y movidas a un invernadero con condiciones para crecimiento de plantas de maíz normales. Las plantas después fueron autopolínizadas o cruzadas con plantas de tipo silvestre.

EJEMPLO 4 Análisis molecular para ADN de estructura de base y número de copias A. Soya transformada con construcciones de un T-ADN ADN fue extraído de muestras de tejido recolectadas de plantas crecidas en invernadero transformadas con plásmido de ADN de la presente invención. Un método basado en PCR se usó para probar el ADN para la presencia de la secuencia oriRi usando iniciador hacia delante repA 5 -ACAAGGTAGAATCCGCCTGAG-3' (Xd487b; SEQ ID NO:11 ) e iniciador de reversa repA 5 -TTCAACTCTGGCATCTCAGAC-3' (Xd488; SEQ ID NO:12) como un indicador de estructura de base de vector. Este ADN es adyacente al LB y su presencia en el ADN extraído de las plantas regeneradas indica que la transferencia de secuencias de vector más allá de LB ha ocurrido. El ADN se puede aislar de tejidos vegetales por un número de métodos, por ejemplo, el procedimiento CTAB (Rogers et al., 1985) o DNAeasy™ 96 Plant Kit (Cat. # 69181 , Qiagen Inc., Valencia, Calif.) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) se describe como un método en la detección y cuantificación de la presencia de una secuencia de ADN y es completamente entendido en las instrucciones provistas por el fabricante. Moléculas de iniciador de ADN (SEQ ID NO:11 y 12) se usaron en el método descrito para identificar el ADN de oriRi de extractos de plantas. Las condiciones y aparatos usados pueden ser modificados por los expertos en la técnica para proveer los mismos resultados. El eje del meristemo de soya cortado de semillas maduras fue transformado con un plásmído de ADN de control (pMON67438 o pMON83898) y un plásmido de la presente invención (pMON83882 o pMON83937), después fue regenerado en plantas intactas. Las plantas intactas se analizaron para la presencia del gen de interés (CP4) y secuencias de oriRi y oriV de no T-ADN. El cuadro 3 muestra los resultados de este análisis. De las 39 plantas probadas, sólo 3 tuvieron secuencias de estructura de base de vector, una frecuencia de 7.7%. En comparación, el plásmido de control (un plásmido oriV) mostró una frecuencia de estructura de base de 21 % a 25% (dependiendo de qué muestras se consideraron). Esta diferencia fue muy drástica y completamente inesperada. Otro componente importante de una planta transgénica comercialmente viable es la aparición de complejidad de inserto baja. Esto a menudo se refiere como "número de copia bajo." Es difícil seleccionar progenie y reproducir exitosamente el rasgo transgénico si el número de copias del inserto es demasiado alto. Idealmente, sólo una copia del transgen estaría presente en un evento transgénico. El número de copias se puede determinar por varios métodos conocidos en la técnica de biología molecular. El análisis de Southern blot es el método más comúnmente usado. Los métodos que usan la tecnología Invader® (Third Wave Inc. Madison, Wl) también se usan para determinar el número de copias de ¡nsertos de T-ADN en plantas transgénicas. Las células de plantas de soya se transformaron con un plásmido de ADN de control (pMON67438) y un plásmido de la presente invención (pMON83882), después se regeneraron en plantas intactas, como se describió antes. Las plantas transgénícas resultantes se analizaron para número de copias usando dos métodos diferentes: 1 ) Método "Invader CP4" y 2) Southern blotting. Los resultados se muestran en el cuadro 3.

CUADRO 3 Efectos de estructura de base de vector pRi ori sobre la frecuencia de transformación, número de copias, y el inserto en transformación de soya. a Datos de acervo de tres lados por experimentos de lados. b Número de plantas del lado por comparación de lados. c Número de plantas de acervo de plantas pMON67438 producidas Usando el método de "Invader CP4", el plásmido inventivo, pMON83882, dio por resultado eventos de transformación de una copia sola 41 % del tiempo, en comparación con el plásmido de control pMON67438 que dio por resultado un evento de transformación de una sola copia únicamente 25% del tiempo usando muestras en acervo de otros experimentos o sólo 37% del tiempo usando experimentos de lado a lado. Considerando eventos de una y dos copias juntos, pMON83882 dio por resultado dichos eventos 79.5% del tiempo, en comparación con 60% de experimentos lado a lado y 63% de las muestras en acervo utilizando el plásmido de control. Usando la comparación de Southern blotting, pMON83882 produjo eventos de una copia 56.4% del tiempo y 33.3% del tiempo eventos de dos copias, para un total de casi 90% de eventos de una y dos copias combinados. Nuevamente, estos resultados fueron tanto drásticos como inesperados.

B. Análisis molecular de número de copias de transgen en dos transformantes de T-ADN de soya. A fin de analizar el impacto de oriRi sobre la transformación de 2T-ADN, el vector oriRi 2T de 4.2 kb r pMON96001 se comparó lado por lado con el vector oriV 2T pMON87488 durante seis meses. El vector oriRi 2T de 5.6 kb pMON96010 también se incluyó en los últimos dos experimentos de comparación en estos experimentos preliminares (cuadro 4, grupo A). El ADN total se extrajo de segmentos de semilla de semillas maduras cosechadas del invernadero y usadas para determinar número de copias de transgen por tecnología Invader usando sonda de CP4 y sondas NOS. La prueba de detección de CP 4 Invader® usó la siguiente secuencia como un sitio objetivo: 5' TCGCTTTCCTTGACGCGGAGTTCTTCCA GACCGTTCAT CACGG 3' (SEQ ID NO: 13) y GTAGGTGATTGGCGTTG (SEQ ID NO:14) como una secuencia de sonda. La prueba de detección NOS Invader® usó las siguientes secuencias nos 3' como un sitio objetivo TGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACT (SEQ ID NO: 15 y GTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGA (SEQ ID NO: 16) como secuencia de sonda NOS Invader®». Los transformantes de 1 y/o 2 copias se incrementaron de 35% en el vector oriV de control a por arriba de 40% en ambos vectores de oriRi. La frecuencia de plantas libres de marcadores en plantas RO (eventos/plantas RO totales libres de marcadores) se incrementó de 4.76% en el vector control de oriV a 16.4% y 18.4%, respectívamente, en los dos vectores de oriRi. En general, la frecuencia de transformación libre de marcadores (eventos/número de explantes inicial libres de marcadores) fue más del doble en los dos vectores de oriRi 2T comparada con el vector oriV 21. Experimentos en paralelo adicionales con número de explantes inicial más grande se usaron además para comparar el vector oriV control 2T con el vector oriRi 2T de 4.2 kb (cuadro 4, grupo B). el vector oriRi 2T reprodujo los resultados: una frecuencia de evento de 1 +2 copias y la frecuencia libre de marcadores (MF%) se incrementan ambas y la frecuencia de transformación libre de marcadores es más del doble en el vector oriRi. Los resultados indican que los vectores de oriRi 2T son significativamente más eficientes para producir plantas libres de marcadores que el vector de oriV 2T al incrementar los eventos de copia baja y mejorar la frecuencia de transformación libre de marcadores.

CUADRO 4 Efecto de tipo del origen de replicación sobre la transformación de vector 2T-ADN de soya. Nota: 1) TF: frecuencia de transformación =R0 plantas/explantes totales; 2) Co-T de 1 +2 copias: co-transformantes de 2 T-ADN de marcador gus y CP4 con 1 y/o 2 copias. Sólo eventos de 1 o y/o 2 copias se anticiparon además para analizar la segregación del marcador en semillas; 3) eventos de MF: eventos libres de marcadores positivos de gen gus de los co-transformantes de 1+2 copias analizados por segregación de semilla; 4) MF % de plantas: plantas/RO # positivo de gus, libre de marcadores; 5) Frecuencia de transformación libre de marcadores (MF TF) =evento no enlazado # / explante inicial # C. Análisis molecular de ADN de estructura de base y Número de copias de transqen en maiz transformado con una construcción de T-de ADN Para investigar el efecto de origen de replicación de oriRi sobre transformación de maíz, el vector oriRi de 5.6 kb pMON97352 que contenía genes gus y CP4, ambos activados por promotor de actina de arroz, se comparó con el vector oriV pMON92726 con la misma estructura de T-ADN que contenía los genes gus y CP4. Embriones inmaduros de maíz de Cultivar LH244 se inocularon con Agrobacterium que contenía ya sea el vector oriRi o el vector oriV en paralelo. Cada tratamiento consistió de aproximadamente 110 embriones. En total 16 experimentos de comparación de lado a lado se iniciaron. El vector oriRi mostró frecuencia de transformación significativamente más baja que el vector oriV control (figura 10) con TF promedio de 9.5% y 16.3% para vectores oriRi y oriV, respectivamente. Sin embargo, la eficiencia de transformación global con vectores oriRi y oriV fue la misma. La presencia de secuencia de estructura de base en plantas de maíz transgénicas se determinó por prueba de Endpoint TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) para la secuencia oriRi o oriV, secuencias LB que son 3' flanqueantes para lectura corta cerca del sitio de ruptura de LB y secuencias de RB que son 5' flanqueantes antes del sitio de ruptura de RB para lectura de estructura de base intacta. Los iniciadores oriV 5' AACGCCTGATTTTACGCGAG 3' (hacia adelante; SEQ ID NO: 17) y 5' CAATACCGCAGGGCACTTATC 3' (reversa; SEQ ID N0:18), con sonda CCCACAGATGATGTGGAC (SEQ ID NO:19) marcada con colorante fluorescente 6-FAM en el extremo 5'. Los iniciadores oriRi son 5' TGGCAAGGAATGGGTTTGAG 3' (hacia adelante; SEQ ID NO:20) y 5' CTACAACTACAGGCGCTGCTTTT 3' (reversa; SEQ ID NO:21 ) con la sonda 6-FAM-TGGCGAAGTCTGTCC (SEQ ID NO:22) para detectar secuencia de oriRi 621 pb hacia el extremo 3' del sitio de ruptura de LB. Los iniciadores flanqueantes de RB 5' son 5' GCCAAGGGATCTTTTTGGAAT 3' (hacia adelante; SEQ ID NO:23) y 5' CCACCCAAACGTCGGAAA 3' (reversa; SEQ ID NO:24) con la sonda 6FAM-TGCTCCGTCGTCAGG (SEQ ID NO:25) para detectar 5' RB flanqueante 186 pb antes del sitio de ruptura de RB. Los iniciadores para detectar LB 35 pb hacia el extremo 3' del sitio de ruptura de LB fueron 5' GCACCCGGTGGAGCTT 3' (hacia adelante; SEQ ID NO:26) y 5' TCTGCCTAACCGGCTCAGT 3' (reversa; SEQ ID NO:27) con la sonda CATGTTGGTTTCTACGCAG (SEQ ID NO:28) marcado con colorante fluorescente 6-FAM en el extremo 5'. Aproximadamente 10 ng de ADN se usó para reacción de Endpoínt TaqMan® de conformidad con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Como se muestra en la figura 11 , aproximadamente 95% de las plantas transgénicas derivadas de vector oriRi fueron libres de estructura de base, que es significativamente mejor que el control de vector oriV que muestra aproximadamente 78% de frecuencia libre de estructura de base. Puesto que la estructura de base del vector empieza en LB después del sitio de ruptura y termina antes del sitio de ruptura de RB, el uso de tres sondas de estructura de base diferentes (LB hacia el extremo 3', oriRi/orN y RB hacia el extremo 5') en plantas derivadas tanto de vector oriRi como oriV reveló que la mayor parte de la estructura de base del vector transferida contenía la secuencia de estructura de base del vector entera. El número de copias de transgen CP4 se determinó por la prueba Invader® de conformidad con las instrucciones del fabricante (Third Wave Technologies Inc. Madison, Wl) usando la secuencia de CP4. El número de copias del transgen gus se midió determinando el terminador transcripcional de cassette de gus pinll (mostrado como Pis 4 en las figuras 5 y 6) usando tecnología TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los iniciadores pinll TaqMan® fueron 5' ATGAAATAAAAGGATGCACACAT 3' (hacia adelante; SEQ ID NO:29) y 5' ACAACTTTGATGCCCACATT 3' (reversa; SEQ ID NO:30) con la sonda TGACATGCTAATCAC- (SEQ ID NO:31 ) marcada con colorantes fluorescentes 6-FAM en el extremo 5' y MGBNFQ en el extremo 3'. La figura 12 muestra los resultados de prueba del número de copias del transgen. El vector oriRi incrementó significativamente la frecuencia de planta de una sola copia comparando al vector de control oriV, mientras que la frecuencia de eventos de 2 o más copias en vector oriRi se redujo. Tanto la prueba TaqMan® como Invader® con dos sondas diferentes mostraron resultados similares. Puesto que las plantas libres de estructura de base de una sola copia son las más valiosas para investigación y desarrollo, el vector oriRi que incrementa la frecuencia de una sola copia y reduce eventos que contienen estructura de base en maíz representa una mejora significativa para calidad en producción de eventos transgénícos.

EJEMPLO S Construcción de vector de transformación de plantas que contiene origen de replicación de repABC de Rhizobium Para clonar el origen de replicación de repABC de la cepa CFN42 de Rhizobium etli, la cepa USDA se obtuvo de USDA Rhizobium Collection Center. Un fragmento de repABC de 4.3 kb se amplificó del plásmido p42b de R. etli encontrado en la cepa CFN42 por PCR con iniciadores 5' CCACGTGAGTTACGGCTGATCGACCAGAC 3' (Xd745; SEQ ID NO:9) y 5' GCCTAGGACGTCAACTCCAACCGCACCGT 3' (Xd746; SEQ ID NO: 10) y se ligó a vector de clonación rasurado TOPO (Invitrogen, Carisbad, CA, E.U.A.), que dio por resultado pMON96941 y se confirmó por secuenciación. El fragmento repABC fue digerido con Pmll y Avrll (mostrado por la secuencia subrayada en iniciadores) y ligado a pMON96948 abierto con Smal y Avrll. El ligado fue directamente transferido a células competentes de Agrobacterium tumefaciens AB2 (una cepa sensible a kanamicina), y se colocó en una placa de LB con kanamicína 50 mg/l. Las colonias kan resistentes se inocularon en un medio de LB líquido con 50 mg/l de kanamicina, y un ADN de plásmido se preparó por minipreparación. La construcción se confirmó por digestión de restricción. Puesto que el vector pMON96951 no contiene un origen de replicación de E. coli, no se puede mantener en E. coli. pMON96951 (figura 13) se usa para transformar especies de plantas como se describió antes. Los eventos transgénicos se analizan para integración de estructura de base de vector reducida y alta frecuencia de eventos de transformación de copia baja por métodos descritos en el ejemplo 4. Otras modalidades de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica al considerar la especificación y práctica de la invención aquí descrita. Se pretende que la especificación y los ejemplos se consideren únicamente como ilustrativos, con el alcance y espíritu verdaderos de la invención siendo indicados por las siguientes reivindicaciones.

REFERENCIAS Las siguientes se incorporan aquí por referencia: Patente de E.U.A. 4,581 ,847; Patente de E.U.A. 4,761 ,373; Patente de E.U.A. 4,810,648; Patente de E.U.A. 5,004,863; Patente de E.U.A. 5,013,659; Patente de E.U.A. 5,034,322; Patente de E.U.A. 5,094,945; Patente de E.U.A. 5,141 ,870; Patente de E.U.A. 5,159,135; Patente de E.U.A. 5,229,1 14; Patente de E.U.A. 5,273,894; Patente de E.U.A. 5,276,268; Patente de E.U.A. 5,304,730; Patente de E.U.A. 5,378,824; Patente de E.U.A. 5,463,175; Patente de E.U.A. 5,463,175; Patente de E.U.A. 5,512,466; Patente de E.U.A. 5,516,671 ; Patente de E.U.A. 5,518,908; Patente de E.U.A. 5,543,576; Patente de E.U.A. 5,561 ,236; Patente de E.U.A. 5,591 ,616; Patente de E.U.A. 5,597,717; Patente de E.U.A. 5,605,011 ; Patente de E.U.A. 5,608,149; Patente de E.U.A. 5,627,061 ; Patente de E.U.A. 5,633,435; Patente de E.U.A. 5,633,437; Patente de E.U.A. 5,633,444; Patente de E.U.A. 5,637,489; Patente de E.U.A. 5,646,024; Patente de E.U.A. 5,689,041 ; Patente de E.U.A. 5,716,837; Patente de E.U.A. 5,719,046; Patente de E.U.A. 5,750,871 ; Patente de E.U.A. 5,750,876; Patente de E.U.A. 5,767,366; Patente de E.U.A. 5,773,696; Patente de E.U.A. 5,824,877; Patente de E.U.A. 5,846,797; Patente de E.U.A. 5,939,602; Patente de E.U.A. 5,942,664; Patente de E.U.A. 5,958,745; Patente de E.U.A. 5,985,605; Patente de E.U.A. 5,998,700; Patente de E.U.A. 6,011 ,199; Patente de E.U.A. 6,013,864; Patente de E.U.A. 6,040,497; Patente de E.U.A. 6,063,597; Patente de E.U.A. 6,063,756; Patente de E.U.A. 6,072,103; Patente de E.U.A. 6,080,560; Patente de E.U.A. 6,093,695; Patente de E.U.A. 6,110,464; Patente de E.U.A. 6,121 ,436; Patente de E.U.A. 6,166,292; Patente de E.U.A. 6,171 ,640; Patente de E.U.A. 6,225,105; Patente de E.U.A. 6,228,992; Patente de E.U.A. 6,252,148; Patente de E.U.A. 6,268,549; Patente de E.U.A. 6,316,407; Patente de E.U.A. 6,380,466; Patente de E.U.A. 6,384,301 ; Patente de E.U.A. 6,414,222; Patente de E.U.A. 6,444,876; Patente de E.U.A. 6,476,295; Patente de E.U.A. 6,506,962; Patente de E.U.A. 6,531 ,648; Patente de E.U.A. 6,537,750; Patente de E.U.A. 6,613,963; Patente de E.U.A. 6,624,344; Patente de E.U.A. 7,002,058; Publicación de patente de E.U.A.. 2003/0028917; Publicación de patente de E.U.A. 20040177399; Publicación de patente de E.U.A. Publicación de patente de E.U.A. 20030083480; Publicación de patente de E.U.A. 20030115626; Publicación de patente de E.U.A. 20050005321 ; Publicación de patente de E.U.A. 20030135879; Solicitud provisional de E.U.A 60/800,872; solicitud del PCT WO04074443; solicitud del PCT WO04009761 ; solicitud del PCT W09927116; solicitud del PCT WO8704181A1 ; solicitud del PCT WO8900193A; solicitud del PCT W08911789; solicitud del PCT WO 9638567; solicitud del PCT WO05107437; solicitud del PCT WO05003362 Solicitud europea 275,957 Solicitud Japonesa. 06343473 Ammirato et al., En: Handbook of Plant Cell Culture--Crop Species, Macmillan Publ. Co., 1984. Ausubel ef al., En: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Ine, NY, 6.3.1 -6.3.6, 1989. Binns y Howitz, En: Bacterial Pathogenesis of plants and Animáis, Dang (Ed.), Berlin: Stringer Verlag, 119-138, 1994. Broothaerts et al., Nature, 433:629-633, 2005. Datta ef al., Bio/Technology, 8:736-740, 1990. Fraley et al., Bio/Technology, 3:629-635, 1985. Fromm, UCLA Symposium on Molecular Strategíes for Crop Improvement, Apr. 16-22, CO, 1990.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una construcción de ADN para transformar plantas que comprende: i) por lo menos una región de borde de T-ADN; ii) por lo menos un transgen heterólogo adyacente a la región de borde; iii) una región codificadora para un marcador seleccionable bacteriano; y iv) por lo menos un segmento de ADN, que comprende un elemento cis y/o trans de un origen de replicación para mantener un número de copia bajo de la construcción de ADN en una bacteria competente para la transformación de por lo menos una primera célula vegetal. 2.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos una región de borde de T-ADN es ya sea una región de borde derecho o una región de borde izquierdo. 3.- La construcción de-ADN-de-conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el transgen heterólogo cuando se expresa en una célula vegetal transformada provee un fenotipo agronómico a la célula o una planta transformada derivada de la célula. 4.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la región codificadora para el marcador seleccionable bacteriano comprende un gen de resistencia a antibióticos seleccionado del grupo que consiste de un gen de resistencia a kanamicina, gen de resistencia a gentamicina, gen de resistencia a cloranfenicol, gen de resistencia a espectinomicina, gen de resistencia a estreptomicina, gen de resistencia a tetraciclina, gen de resistencia a ampicilina, gen de resistencia a blasticidina, gen de resistencia a higromicina, gen de resistencia a puromicina, o gen de resistencia a Zeocina. 5.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el origen de replícación comprende un origen de repABC. 6.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el origen de repABC se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. . 7.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos un segmento de ADN comprende genes de replicación repA, repB y repC. 8.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos un segmento de ADN comprende secuencia intergénica 1 (igsl ) y secuencia intergénica 2 (igs2). 9.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque por lo menos un segmento de ADN comprende una secuencia palindrómíca de 16 pares de bases. 10.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Agrobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. 1 1 .- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende además por lo menos un primer origen de replicación para mantener copias de la construcción en E. coli. 12.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el origen de replicación se deriva de pBR322 y/o pUC. 13.- Una célula transformada con la construcción de ADN de la reivindicación 1 . 14.- La célula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque está definida como una célula vegetal. 15.- La célula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque está definida como una célula bacteriana. 16.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque la célula es competente para la transformación de por lo menos una primera célula vegetal. 17.- La célula bacteriana de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Agrobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacterium spp.. Ochrobactrum spp. y Bradyrhizobium spp. 18.- Un método para transformar una célula vegetal que comprende poner en contacto por lo menos una primera célula vegetal con la célula bacteriana de la reivindicación 16, en donde la célula bacteriana es competente para la transformación de la primera célula vegetal; y seleccionar la primera célula basada en la presencia de por lo menos un transgen heterólogo introducido en la célula vegetal por la célula bacteriana. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la célula vegetal es una célula de planta de soya, cañóla, maíz o algodón. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende además regenerar una planta a partir de la célula vegetal. 21.- Un método para producir alimento, alimento para ganado o un producto industrial que comprende: obtener la planta de la reivindicación 20 o una parte de la misma; y preparar el alimento, alimento para ganado o un producto industrial a partir de la planta o parte de la misma.