MX2007005364A - Ensayo de deteccion de una sola etapa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona metodos y rutinas para desarrollar y optimizar los ensayos de deteccion del acido nucleico para el uso en la investigacion basica, investigacion clinica, y para el desarrollo de ensayos de deteccion clinicos. En particular, la presente invencion proporciona metodos para disenar cebadores oligonucleotidos que se utilizaran en reacciones de amplificacion multiples. La presente invencion tambien proporciona metodos para optimizar reacciones de amplificacion multiples. La presente invencion tambien proporciona metodos para ensayos de generacion de blancos y senales combinados.

Description

ENSAYO DE DETECCIÓN EN UNA SOLA ETAPA Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada La presente solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud Provisional Norteamericana 60/624,626, presentada el 3 de noviembre de 2004. Campo de la Invención La presente invención proporciona métodos para combinar reacciones objetivo de transcripción inversa, reacciones de amplificación, y reacciones de amplificación de señal para obtener una detección rápida y sensible de cantidades pequeñas de ácidos nucleicos, particularmente en fluidos corporales sin purificar (por ejemplo sangre). La presente invención también proporciona métodos para optimizar reacciones de amplificación múltiplex. La presente invención también proporciona métodos para realizar la PCR (reacción de la cadena de polimerasa) altamente múltiplexada en combinación con el ensayo INVADER. La presente invención además proporciona métodos para realizar, en combinación, la transcripción inversa, PCR y el ensayo INVADER en un solo recipiente de reacción (por ejemplo utilizando fluidos corporales sin purificar tal como sangre) sin la necesidad de manipulaciones que intervengan o adiciones de reactivo. Antecedentes de la Invención Con la finalización del secuenciado del ácido nucleico del genoma humano, la demanda de pruebas rápidas, confiables, económicas y de uso fácil para búsquedas genómicas y los esfuerzos por diseños de fármaco liberado, se han incrementado mayormente. Un número de instituciones activamente recolectan la información de secuencia genética disponible para identificar las correlaciones entre genes, expresión del gen y fenotipos (por ejemplo, estados de la enfermedad, respuestas metabólicas, y similares). Estos análisis incluyen una tentativa para caracterizar el efecto de las mutaciones del gene y heterogeneidad de la expresión genética y del gen en individuos y poblaciones. La transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) y la reacción de la cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) son críticas para varias aplicaciones biológicas moleculares y relacionadas, particularmente aplicaciones para el análisis de la expresión del gen. En estas aplicaciones, la transcripción inversa se utiliza para preparar el ADN patrón de una muestra de ARN inicial (por ejemplo mARN) cuyo ADN patrón entonces se amplifica usando la PCR para producir una cantidad suficiente de producto amplificado para la aplicación de interés. Los avances en la extracción y amplificación del ácido nucleico se han extendido mayormente en los tipos de muestras biológicas de las cuales puede obtenerse el material genético. En particular, la PCR ha permitido obtener cantidades suficientes de ADN a partir de muestras de tejido fijo, especímenes arqueológicos, y cantidades de muchos tipos de células que se numeran en los dígitos únicos. Similarmente, los proyectos de genotipos en SNP a gran escala requieren cantidades de ADN genómico que pueden ser difíciles de obtener de muestras biológicas estándares. Un proceso para tratar este problema se apoya en la amplificación del objetivo basado en PCR. Aún cuando la PCR permite el análisis de cantidades diminutas de ácidos nucleicos, su aplicación práctica en un número de ajustes y para un número de tipos de problemas, sigue siendo problemática. Debido a que las cantidades pequeñas de ácido nucleico objetivo se amplifican fácilmente por la reacción, las aplicaciones de PCR son altamente susceptibles para llevar consigo contaminantes de ensayo a ensayo. Esta vulnerabilidad frecuentemente necesita el establecimiento de instalaciones dedicadas o la configuración de flujos de trabajo que minimice el número de manipulaciones de postamplificación. En algunos casos, se utiliza la instrumentación especializada que permite que las reacciones sean monitoreadas en tiempo real sin abrir los recipientes de reacción. Cuando sea necesario, entonces, es un método que limita la necesidad de la amplificación objetivo maximizando la generación de señal a partir de cantidades pequeñas de secuencias amplificadas, y que niega eficientemente la susceptibilidad para trasladar la contaminación mientras se retenga la sensibilidad de la detección. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos y rutinas para desarrollar y optimizar los ensayos de detección del ácido nucleico para uso en la búsqueda básica, búsqueda clínica, y para el desarrollo de ensayos de detección clínicos.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden; a) proporcionar la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, y b) procesar la información de la secuencia objetivo tal que es generado un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende una secuencia de cebador delantera e inversa para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia de ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', en donde N representa una base de nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido A ó C, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden; a) proporcionar la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, y b) procesar la información de la secuencia objetivo tal que se genera un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende una secuencia de cebador delantera e inversa para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia de ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3\ en donde N representa una base de nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido G o T, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En las modalidades particulares, un método comprende; a) proporcionar la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, y b) procesar la información de la secuencia objetivo tal que se genera un cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la región 5' para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la región 3' para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia de ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido A ó C, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden a) proporcionar la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, y b) procesar la información de la secuencia objetivo tal que se genera un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la región 5' para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la región 3' para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia de ácido nucleico representada por 5,-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-Nf1]-3', en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido G o T, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador.

En modalidades particulares, la presente invención proporciona métodos que comprenden a) proporcionar la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende un polimorfismo de un solo nucleótido, b) determinar donde en cada una de las secuencias objetivo una o más sondas de ensayo se podrán hibridizar para detectar el polimorfismo del nucleótido único tal que una región de huella se localiza en cada una de las secuencias objetivo, y c) procesar la información de la secuencia objetivo tal que se genera un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la secuencia objetivo inmediatamente de 5' de la región de huella para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la secuencia objetivo inmediatamente de 3' de la región de huella para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia de ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', en donde N representa una base de nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido A ó C, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden a) proporcionar la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende un polimorfismo de un solo nucleótido, b) determinar donde, en cada una de las secuencias objetivo, una o más sondas de ensayo podrán hibridizarse para detectar el polimorfismo de un solo nucleótido tal que una región de huella se localiza en cada una de las secuencias objetivo, y c) procesar la información de la secuencia objetivo tal que se genera un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la secuencia objetivo inmediatamente de 5' de la región de huella para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la secuencia objetivo inmediatamente de 3' de la región de huella para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia de ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3\ en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido T ó G, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En ciertas modalidades, el grupo cebador se configura para realizar una reacción de PCR múltiplex que amplifique por lo menos los amplicones Y, en donde cada uno de los amplicones se define por la posición de los cebadores delantero e inverso. En otras modalidades, el grupo cebador se genera como la información de la secuencia digital o impresa. En algunas modalidades, el grupo cebador se genera como los oligonucleótidos del cebador físico. En ciertas modalidades, N[3]-N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[3]-N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En otras modalidades, el proceso comprende seleccionar inicialmente N[1] para cada uno de los cebadores delanteros como el mayor de 3' A o C en la región 5'. En ciertas modalidades, el proceso comprende seleccionar inicialmente N[1] para cada uno de los cebadores delanteros como el mayor de 3' G o T en la región 5'. En algunas modalidades, el proceso comprende seleccionar iniciaimente N[1] para cada uno de los cebadores delanteros, como el mayor de 3' A o C en la región 5', y en donde el proceso comprende además cambiar el N[1] al siguiente mayor de 3' A o C en la región 5' para las secuencias de cebador delantero que carecen del requerimiento donde cada uno de N[2]-N[1]-3' de los cebadores delanteros no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador.

En otras modalidades, el proceso comprende inicialmente seleccionar N[1] para cada uno de los cebadores inversos como el mayor de 3' en A o C en el complemento de la región 3'. En algunas modalidades, el proceso comprenden inicialmente seleccionar N[1] para cada uno de los cebadores inversos como el mayo de 3' en G o T en el complemento de la región 3'. En otras modalidades, el proceso comprenden inicialmente seleccionar N[1] para cada uno de los cebadores inversos como el mayor de 3' en A o C en la región 3', y en donde el proceso comprenden además cambiar el N[1] al siguiente mayor de 3' en A o C en la región 3' para las secuencias de cebador inverso que carecen de requerimiento donde cada uno de N[2]-N[1]-3 del cebador inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En modalidades particulares, la región de huella comprende un polimorfismo de un solo nucleótido. En algunas modalidades, la huella comprende una mutación. En algunas modalidades, la región de huella para cada una de las secuencias objetivo comprende una porción de la secuencia objetivo que hibridiza a una o más sondas de ensayo configuradas para detectar el polimorfismo de un solo nucleótido. En ciertas modalidades, la huella es esta región donde las sondas se someten a hibridación. En otras modalidades, la huella además incluye los nucleótidos adicionales en cualquier extremo. En algunas modalidades, el proceso comprende además seleccionar N[5]-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3' para cada uno de los cebadores delantero e inverso tal que menos de 80 por ciento de homología con una secuencia del componente de ensayo está presente. En modalidades preferidas, el componente de ensayo es una secuencia de sonda FRET. En ciertas modalidades, la secuencia objetivo es cerca de 300-500 pares base en longitud, o aproximadamente de 200-600 pares base en longitud. En ciertas modalidades, Y es un número entero entre 2 y 500, o entre 2-10,000. En ciertas modalidades, el proceso comprende seleccionar x para cada uno de los cebadores delantero e inverso tal que cada uno de los cebadores delantero e inverso tenga una temperatura de fusión con respecto a la secuencia objetivo de aproximadamente 50 grados centígrados (por ejemplo 50 grados, centígrados, o por lo menos 50 grados centígrados, y no más de 55 grados centígrados). En modalidades preferidas, la temperatura de fusión de un cebador (cuando se somete a hibridación a la secuencia objetivo) es por lo menos 50 grados centígrados, pero por lo menos 10 grados de diferencia que una temperatura de reacción óptima de un ensayo de detección seleccionado. En algunas modalidades, las concentraciones optimizadas del par cebador delantero e inverso se determinan para el grupo cebador. En otras modalidades, se automatiza el proceso. En otras modalidades, el proceso se automatiza con un procesador. En otras modalidades, la presente invención proporciona un kit que comprende el grupo cebador generado por los métodos de la presente invención, y por lo menos otro componente, (por ejemplo agente de división, polimerasa, oligonucleótido INVADER). En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones que comprenden cebadores y grupos de cebadores generados por los métodos de la presente invención.

En modalidades particulares, la presente invención proporciona métodos que comprenden; a) proporcionar; i) una interfaz de usuario configurada para recibir datos de la secuencia, ii) un sistema informático que tiene almacenado en el mismo, una aplicación de software del cebador de PCR múltiplex, y b) transmitir los datos de la secuencia desde la interfaz de usuario al sistema informático, en donde los datos de la secuencia comprenden la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, y c) procesar la información de la secuencia objetivo con la aplicación del software del par cebador de PCR múltiplex para generar un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la secuencia objetivo inmediatamente de 5' de la región de huella para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la secuencia objetivo inmediatamente de 3' de la región de huella para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia del ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido A ó C, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden; a) proporcionar; i) una interfaz de usuario configurada para recibir datos de la secuencia, ii) un sistema informático que tiene almacenado en el mismo, una aplicación de software del cebador de PCR múltiplex, y b) transmitir los datos de la secuencia desde la interfaz de usuario al sistema informático, en donde los datos de la secuencia comprenden la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ¡i) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, y c) procesar la información de la secuencia objetivo con la aplicación del software del par cebador de PCR múltiplex para generar un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la secuencia objetivo inmediatamente de 5' de la región de huella para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la secuencia objetivo inmediatamente de 3' de la región de huella para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia del ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido G ó T, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona sistemas que comprenden; a) un sistema informático configurado para recibir datos desde una interfaz de usuario, en donde la interfaz de usuario se configura para recibir datos de la secuencia, en donde los datos de la secuencia comprenden la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii) una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, b) una aplicación del software del par cebador de PCR múltiplex operablemente ligada a la interfaz de usuario, en donde la aplicación del software de cebador de PCR múltiplex se configura para procesar la información de la secuencia objetivo para generar un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la secuencia objetivo inmediatamente de 5' de la región de huella para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la secuencia objetivo inmediatamente 3' de la región de huella para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia del ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido A ó C, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador, y c) un sistema informático que almacena en el mismo la aplicación del software de cebador de PCR múltiplex, en donde el sistema informático comprende una memoria de computadora y un procesador de computadora. En otras modalidades, la presente invención proporciona sistemas que comprenden; a) un sistema informático configurado para recibir datos desde una interfaz de usuario, en donde la interfaz de usuario se configura para recibir datos de la secuencia, en donde los datos de la secuencia comprenden la información de la secuencia objetivo para por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias objetivo comprende; i) una región de huella, ii), una región 5' inmediatamente corriente arriba de la región de huella, e iii) una región 3' inmediatamente corriente abajo de la región de huella, b) una aplicación del software del par cebador de PCR múltiplex operablemente ligada a la interfaz de usuario, en donde la aplicación del software de cebador de PCR múltiplex se configura para procesar la información de la secuencia objetivo para generar un grupo cebador, en donde el grupo cebador comprende; i) una secuencia de cebador delantera idéntica a por lo menos una porción de la secuencia objetivo inmediatamente de 5' de la región de huella para cada una de las secuencias objetivo Y, e ii) una secuencia de cebador inversa idéntica a por lo menos una porción de una secuencia complementaria de la secuencia objetivo inmediatamente de 3' de la región de huella para cada una de por lo menos las secuencias objetivo Y, en donde cada una de las secuencias de cebador delantera e inversa comprende una secuencia del ácido nucleico representada por 5'-N[x]-N[x-1]-....-N[4]-N[3]-N[2]- N[1]-3', en donde N representa una base del nucleótido, x es por lo menos 6, N[1] es el nucleótido G ó T, y N[2]-N[1]-3' de cada uno de los cebadores delantero e inverso no es complementario a N[2]-N[1]-3' de cualquiera de los cebadores delantero e inverso en el grupo cebador, y c) un sistema informático que almacena en el mismo la aplicación del software de cebador de PCR múltiplex, en donde el sistema informático comprende una memoria de computadora y un procesador de computadora. En ciertas modalidades, el sistema informático se configura para regresar el grupo cebador a la interfaz de usuario. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para conducir reacciones de amplificación de la señal y objetivo y de transcripción inversa en un solo recipiente de reacción. En algunas modalidades preferidas, las reacciones de amplificación del objetivo son reacciones de PCR. En algunas modalidades particularmente preferidas, las reacciones de amplificación de señal son ensayos de división invasivos (INVADER). En otras modalidades, los reactivos para las reacciones combinadas de amplificación de un objetivo y de señal se agregan antes de la iniciación de cualquier reacción. En ciertas modalidades, las reacciones de amplificación del objetivo se terminan después de 20 ciclos. En algunas modalidades preferidas, las reacciones de amplificación del objetivo se terminan después de 15 ciclos. En algunas modalidades particularmente preferidas, las reacciones de amplificación del objetivo se terminan después de 11 ciclos. En algunas modalidades, algunos componentes son predisponen en un recipiente de reacción antes de la adición de los componentes restantes del ensayo. En modalidades preferidas, los reactivos predispuestos se secan en el recipiente de reacción. En modalidades particularmente preferidas, los reactivos predispuestos comprenden uno o más reactivos de ensayo INVADER. En algunas modalidades, el recipiente de reacción comprende una tarjeta microfluídica. En modalidades preferidas, el recipiente de reacción comprende una tarjeta microfluídica configurada para la distribución o manipulación centrífuga o centrípeta de las reacciones de fluidos y de los componentes de reacción. En aún otras modalidades, la presente invención proporciona métodos y las composiciones para conducir ensayos múltiplex de multi-teñidos FRET INVADER, por ejemplo, en un recipiente de reacción o de una sola reacción. En algunas modalidades preferidas, los ensayos de FRET múltiplex se realizan en objetivos sintéticos. En otras modalidades preferidas, los ensayos múltiplex FRET se realizan en objetivos de fragmento del ácido nucleico, por ejemplo, amplicones de PCR. En algunas modalidades particularmente preferidas, los ensayos múltiplex FRET se realizan en objetivos genómicos del ADN. En aún otras modalidades preferidas, los ensayos múltiplex FRET se realizan en objetivos de ARN. En algunas modalidades particularmente preferidas, los ensayos múltiplex FRET son reacciones tetraplex. En algunas modalidades, uno o más reactivos de ensayo INVADER se pueden proporcionar en un formato predispuesto (es decir, premedido para el uso en una etapa del procedimiento sin la nueva medida o re-disposición). En algunas modalidades, los componentes seleccionados del reactivo de ensayo INVADER se mezclan y predisponen juntos. En otras modalidades, los componentes del reactivo de ensayo predispuestos son predispuestos y se proporcionan en un recipiente de reacción (incluyendo pero no limitado a un tubo de reacción o un pozo, como en, por ejemplo, una placa de microtítulo). En modalidades particularmente preferidas, los componentes del reactivo de ensayo INVADER predispuestos se secan (por ejemplo, desecado o liofilizado) en un recipiente de reacción. En algunas modalidades, los reactivos de ensayo INVADER se proporcionan como un kit. Como se utiliza en la presente, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro de materiales de liberación. En el contexto de los ensayos de reacción, tales sistemas de suministro incluyen los sistemas que permiten el almacenaje, transporte, o suministro de los reactivos de la reacción (por ejemplo, oligonucleótidos, enzimas, etc. en los envases apropiados) y/o de materiales de soporte (por ejemplo, amortiguadores, instrucciones escritas para realizar el ensayo, etc.) a partir de una localización a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de la reacción y/o materiales de soporte relevantes. Como se utiliza en la presente, el término "kit fragmentado" se refiere a sistemas de suministro que comprenden dos o más envases separados donde cada uno contiene una subporción de los componentes totales del kit. Los envases se pueden suministrar al recipiente previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer envase puede contener una enzima para el uso en un ensayo, mientras que un segundo envase contiene los oligonucleótidos. El término "kit fragmentado" se desea que comprenda los kits que contienen reactivos específicos del Analito (ASR's) regulados bajo la sección 520(e) de la Federal Food, Drug, and Cosmetic Acto, pero no se limitan a los mismos. De hecho, cualquier sistema de suministro que comprenda dos o más envases separados donde cada uno contiene una subporción de los componentes totales del kit, se incluye en el término "kit fragmentado." En contraste, un "kit combinado" se refiere a un sistema de suministro que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un solo envase (por ejemplo, en una sola caja que contiene cada uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye kits fragmentados y combinados. En algunas modalidades, la presente invención proporciona kits del reactivo de ensayo INVADER que comprenden uno o más de los componentes necesarios para practicar la presente invención. Por ejemplo, la presente invención proporciona kits para almacenar o suministrar las enzimas y/o los componentes de reacción necesarios para practicar un ensayo INVADER. El kit puede incluir cualquiera y todos los componentes necesarios o deseados para los ensayos incluyendo, pero no limitado a, los reactivos por sí mismos, amortiguadores, reactivos de control (por ejemplo, muestras de tejido, oligonucleótidos objetivo de control positivos y negativos, etc.), soportes sólidos, etiquetas, instrucciones escritas e ilustradas e información del producto, inhibidores, reactivos de marcado y/o de detección, paquete de controles del medio ambiente (por ejemplo, hielo, desecativos, etc.), y similares. En algunas modalidades, los kits proporcionan un subconjunto de los componentes requeridos, en donde se espera que el usuario provea los componentes restantes. En algunas modalidades, los kits comprenden dos o más envases separados en donde cada envase contiene un subconjunto de los componentes que se suministrarán. Por ejemplo, un primer envase (por ejemplo, caja) puede contener una enzima (por ejemplo, una estructure de enzima de división específica en un amortiguador y un envase de almacenaje adecuados), mientras que una segunda caja puede contener los oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos I NVADER, oligonucleótidos de sonda, oligonucleótidos objetivo de control, etc.). En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método de detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende exponer una muestra a los reactivos del ensayo de detección bajo condiciones tal que el ácido nucleico objetivo es detectado, en una reacción de una sola etapa, en donde la reacción de una sola etapa comprende una reacción de transcripción inversa, una reacción de la cadena de polimerasa y una reacción del ensayo de división Invasivo. En modalidades preferidas, la reacción de una sola etapa ocurre en un solo tubo de reacción. En algunas modalidades, la reacción de una sola etapa com prende un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como cebador de transcripción inversa, un cebador de la reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido que forma la estructura de división (por ejemplo, una sonda o un olig o I NVADER en una reacción de división I nvasiva) . En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende: exponiendo la muestra a los reactivos de ensayo de detección bajo condiciones tal que el ácido nucleico objetivo es detectado, si está presente, en una reacción de una sola etapa, en donde la reacción de una sola etapa comprende una reacción de la transcripción inversa, una reacción de la cadena de polimerasa y una reacción del ensayo de división invasivo. En algunas modalidades, la muestra es un fluido corporal sin purificar. En algunas modalidades, el fluido comprende sangre. En algunas modalidades, la reacción de la cadena de polimerasa tiene menos de 20 ciclos de amplificación. En algunas modalidades, la reacción de la cadena de polimerasa tiene menos de 15 ciclos de amplificación. En modalidades preferidas, la reacción de la cadena de polimerasa tiene menos de 12 ciclos de amplificación. En algunas modalidades, la reacción de una sola etapa comprende un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como cebador de transcripción inversa, un cebador de la reacción de la cadena de polimerasa y como un oligonucleótido que forma una estructura de división. En algunas modalidades, el ácido nucleico objetivo es ADN genómico mamífero. En algunas modalidades, el ácido nucleico objetivo es de un patógeno. En algunas modalidades, el ácido nucleico objetivo es de una planta. En algunas modalidades, el ácido nucleico objetivo es detectado por fluorescencia. En algunas modalidades, los reactivos comprenden una transcriptasa inversa, una polimerasa, nucleasa 5', y un amortiguador. En algunas modalidades, la concentración del cloruro de potasio del amortiguador es 0 mM. La presente invención proporciona un kit para detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende: uno o más de una transcriptasa inversa, una polimerasa, una nucleasa 5', oligonucleótidos configurados para crear una estructura de división invasiva en presencia del ácido nucleico objetivo, y un amortiguador que permite la transcripción inversa y la amplificación detectable del ácido nucleico objetivo en una muestra. En algunas modalidades, la nucleasa 5' comprende una endonucleasa FEN-1. En algunas modalidades, la concentración de cloruro de potasio del amortiguador es 0 mM. En algunas modalidades, el kit además comprende cebadores de amplificación. En algunas modalidades, el kit además comprende un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como un cebador de la transcripción inversa, un cebador de la reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido que forma la estructura de división. La presente invención también proporciona un kit para detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra, que comprende: una muestra y un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como un cebador de transcripción inversa, cebador de la reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido que forma la estructura de división. La presente invención también proporciona un método para la detección múltiple de los ácidos nucleicos objetivo, que comprende: a) proporcionar la transcripción inversa, la reacción de la cadena de polimerasa, y reactivos del ensayo de división invasivo en una tarjeta microfluídica, en donde los reactivos se configuran para la transcripción inversa, amplificación, y detección de los ácidos nucleicos objetivo; b) exponer una muestra sospechada de contener los ácidos nucleicos objetivo en los reactivos usando la fuerza centrífuga; y c) detectar la presencia o ausencia de los ácidos nucleicos objetivo. En algunas modalidades, la exposición comprende conducir 20 o menos ciclos de reacción de la cadena de polimerasa. En algunas modalidades, los reactivos comprenden una transcriptasa inversa, una polimerasa y nucleasa 5'. En algunas modalidades, la nucleasa 5' comprende una endonucleasa FEN-1. La presente invención también proporciona un kit que comprende una composición de enzima, en donde la composición de enzima comprende una o más enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa y actividad de la endonucleasa FEN-1. En algunas modalidades, el kit comprende una transcriptasa inversa. En algunas modalidades, el kit comprende la endonucleasa FEN- . En algunas modalidades, el kit además comprende una polimerasa. La presente invención también proporciona un método para cuantificar una secuencia del ácido nucleico objetivo en una muestra que comprende exponer la muestra a los reactivo del ensayo de detección bajo condiciones tal que el ácido nucleico objetivo se cuantifica en una reacción de una sola etapa, en donde la reacción de una sola etapa comprende una reacción de transcripción inversa, una reacción de la cadena de polimerasa y una reacción del ensayo de división invasivo. En algunas modalidades, la cuantificación determina la cantidad de la secuencia del ácido nucleico objetivo con relación a la cantidad de una secuencia del ácido nucleico celular en la muestra. En algunas modalidades, los reactivos de ensayo comprenden un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como un cebador de transcripción inversa, un cebador de la reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido que forma la estructura de división . Descripción de las Figuras Las figuras siguientes forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos y modalidades de la presente invención. La invención se puede entender mejor por la referencia a una o más de estas figuras en combinación con la descripción de las modalidades específicas presentadas adjunto. La figura 1 muestra un diagrama esquemático de una modalidad del ensayo I NVADER. En la reacción primaria, la molécula objetivo (rectángulo tramado) forma la estructura de traslape-aleta con la sonda invansiva (rectángulo abierto) y la sonda primaria que incluye la región objetivo-específica (rectángulo abierto) y la aleta 5' (rectángulo rellenado) . La traslape-aleta es dividida por la nucleasa 5' de estructura-específica. El sitio de división de la estructura de traslape-aleta mostrado por la flecha está situado después del nucleótido terminal de 5' de la región objetivo-específica de la sonda primaria. Para la identificación de SNP, el traslape entre las sondas se coloca opuesto del sitio polimórfico (X). Si el nucleótido X no es complementario a la sonda primaria, ninguna división específica ocurre. En la reacción secundaria, la aleta de 5 ' dividida forma la estructura de traslape-aleta con el módulo de FRET (línea gris) marcado con un tinte (d) y el extintor (Q). La división del módulo de FRET por la nucleasa 5' libera el tinte no apagado. Las flechas semicirculares indican el proceso de producción del oligonucleótido esencial para la amplificación de señal. Una cascada similar (no mostrada) se utiliza para la detección del nucleótido SNP alternativo en el ensayo INVADER biplex. La figura 2 es una gráfica que muestra la dependencia del logaritmo del factor de amplificación IgF en el número de ciclos n de PCR para la PCR 5. La figura 3A es una gráfica que muestra el efecto de la concentración del cebador c en IgF para la PCR 1 (•) (PCR 2(o), PCR 4 (u), y PCR 5 (D). La figura 3B es una gráfica que muestra la relación entre ln(2-F0 05) y c usando los datos mostrados en 3A. La figura 4 muestra los diagramas de dispersión de FAM neta y señales del ensayo RED INVADER para ocho muestras del ADN genómico en reacciones según lo descrito en el ejemplo 7. La figura 5 muestra la señal neta de fluorescencia RED normalizada por el alelo para los 161 ensayos acertados INVADER en función de la longitud del objetivo de PCR, en reacciones según lo descrito en el ejemplo 7. La figura 6 muestra los diagramas de dispersión de FAM neta y de las señales RED para las ocho muestras de ADN en reacciones según lo descrito en el ejemplo 7. La figura 7 muestra una gráfica que exhibe los resultados de una reacción combinada de la amplificación de señal y del objetivo de acuerdo con los métodos del ejemplo 8.

La figura 8 muestra que un diagrama de flujo que delínea las etapas que pueden realizarse para generar un grupo cebador útil en el PCR múltiplex. Las figuras 9A y 9B muestran una gráfica que exhibe los resultados de una reacción múltiple combinada de la amplificación de la señal y del objetivo de acuerdo con los métodos del ejemplo 8. La figura 10 muestra una gráfica que exhibe los resultados de un ensayo INVADER tetraplex de acuerdo con lo descrito en el ejemplo 9. Las figuras 11A-11G muestran gráficas que exhiben los resultados de la detección del ensayo INVADER del ADN objetivo amplificado del PCR múltiplex en una tarjeta microfluídica. Las figuras 12A-12G muestan gráficas que exhiben los resultados las reacciones combinadas de la amplificación de señal del ensayo INVADER y de PCR múltiplex en una tarjeta microfluídica.

DEFINICIONES Para facilitar una comprensión de la presente invención, un número de términos y frases se definen abajo: Como se utiliza en la presente, los términos "SNP," "SNPs" o " polimorfismos de un solo nucleótido" se refieren a cambios de una sola base en una localización específica en el genoma de un organismo (por ejemplo, humano). "SNPs" se puede situar en una porción de un genoma que no se codifique para un gen. Alternativamente, un "SNP" se puede situar en la región de la codificación de un gen. En este caso, el "SNP" puede alterar la estructura y la función del ARN o de la proteína con la cual se asocia. Como se utiliza en la presente, el término "alelo" se refiere a una forma variable de una secuencia dada (por ejemplo, incluyendo pero no limitado a, genes que contienen uno o más SNPs). Una gran cantidad de genes está presente en formas alélicas múltiplex en una población. Un organismo diploide que lleva dos diversos alelos de un gene se dice que es heterocigo para ese gene, mientras que un homocigoto lleva dos copias del mismo alelo. Como se utiliza en la presente, el término "vínculo" se refiere a la proximidad de dos o más marcadores (por ejemplo, genes) en un cromosoma. Como se utiliza en la presente, el término "frecuencia de alelo" se refiere a la frecuencia de ocurrencia de un alelo dado (por ejemplo, una secuencia que contiene un SNP) en la población dada (por ejemplo, un género específico, una raza, o grupo étnico). Ciertas poblaciones pueden contener un alelo dado dentro de un porcentaje más alto de sus miembros que otras poblaciones. Por ejemplo, una mutación particular en el gen del cáncer de mama llamada BRCA1 es encontrada para estar presente en un porcentaje de la población judía general. En comparación, el porcentaje de la gente en la población general de los Estados Unidos que tiene cualquier mutación en BRCA1 se ha estimado que está entre 0.1 a 0.6 por ciento. Dos mutaciones adicionales, una en el gene de BRCA1 y otra en el gene del cáncer de mama llamada BRCA2, tienen un mayor predominio en' la población judía Ashkenazi, llevando el riesgo total de llevar una de estas tres mutaciones a 2.3 por ciento.

Como se utiliza en la presente, el término "análisis en silico" se refiere al análisis realizado usando procesadores de computadora y memoria de computadora. Por ejemplo, " análisis en silico de SNP" se refiere al análisis de datos de SNP usando procesadores y memoria de computadora. Como se utiliza en la presente, el término "genotipo" se refiere al maquillaje genético real de un organismo (por ejemplo, en términos de los alelos particulares llevados en un lugar geométrico genético). La expresión del genotipo da lugar al aspecto físico y a las características de un organismo - el "fenotipo". Como se utiliza en la presente, el término "posición" se refiere a la posición de un gene o de cualquier otra secuencia caracterizada respecto en un cromosoma. Como se utiliza en la presente el término "enfermedad" o "estado de la enfermedad" se refiere a una desviación de la condición considerada como normal o promedio para los miembros de una especie, y que es perjudicial a un individuo afectado bajo condiciones que no sean hostiles a la mayoría de los individuos de esa especie (por ejemplo, diarrea, náusea, fiebre, dolor, e inflamación, etc). Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" en referencia a una línea de conducta médica se refiere a las etapas o acciones tomadas con respecto a un individuo afectado como consecuencia de un estado sospechado, anticipado, o existente de la enfermedad, o en donde hay un riesgo o riesgo sospechado de un estado de la enfermedad. El tratamiento se puede proporcionar en anticipación o en respuesta a un estado de la enfermedad o a una sospecha de un estado de la enfermedad, y puede incluir, pero no limitarse a las etapas preventivas, aminorativas, paliativas o curativas. El término "terapia" se refiere a un curso de tratamiento particular. El término "gen" se refiere a una secuencia del ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que abarque las secuencias de codificación necesarias para la producción de un polipéptido, ARN (por ejemplo, rARN, tARN, etc.), o al precursor. El polipéptido, ARN, o el precursor se pueden codificar por una secuencia de codificación de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia de codificación siempre y cuando la actividad" deseada o propiedades funcionales (por ejemplo, unión al ligando, transducción de señal, etc.) de la longitud completa o del fragmento, se conserven. El término también comprende la región de codificación de un gen estructural e incluye las secuencias situadas adyacentes a la región de codificación en los extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 1 kb en cualquier extremo tal que el gen corresponde a la longitud del mARN de longitud completa. Las secuencias que se localizan en 5' de la región de codificación y que están presentes en el mARN, son referidas como secuencias sin traducir 5'. Las secuencias que se localizan en 3' o corriente abajo de la región de codificación y que están presentes en el mARN, son referidas como secuencias sin traducir de 3'. El término "gen" comprende cADN y las formas genómicas de un gene. Una forma o un clon genómico de un gen contiene la región de codificación interrumpida con las secuencias no-codificadas llamadas "intrones" o "regiones que intervienen" o "secuencias que intervienen." Los intrones son segmentos incluidos cuando un gen se transcribe en el ARN nuclear heterogéneo (hnARN); los intrones pueden contener elementos reguladores tales como reforzadores. Los intrones se eliminan o "se ligan" de la transcripción nuclear o primaria; los ¡ntrones por lo tanto están generalmente ausentes en la transcripción del ARN mensajero (mARN). El mARN funciona durante la traducción para especificar la secuencia u orden de aminoácidos en un polipéptido naciente. Las variaciones (por ejemplo, mutaciones, SNPS, inserciones, rechazos) en porciones transcritas de genes se reflejan en, y se pueden detectar generalmente en porciones correspondientes del ARNs producido (por ejemplo, hnARNs, mARNs, rARNs, tARNs). Donde la frase "secuencia del aminoácido" se cita adjunto para referir a una secuencia del aminoácido de una molécula de proteína que ocurre naturalmente, la secuencia del aminoácido y términos similares, tal como polipéptido o proteína, no se desea que limiten la secuencia del aminoácido a la secuencia del aminoácido completa, nativa asociada con la molécula de proteína citada. Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen pueden también incluir las secuencias situadas en el extremo 5' y 3' de las secuencias que están presentes en la transcripción del ARN. Estas secuencias son referidas como secuencias o regiones "que flanquean" (estas secuencias que flanquean están situadas en 5' o 3' a las secuencias no-traducidas presentes en la transcripción del mARN). La región que flanquea 5' puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y reforzadores que controlan o influencian la transcripción del gen. La región que flanquea 3' puede contener las secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, división post-transcripcional y poliadenilación. El término "tipo silvestre" se refiere a un gen o producto del gen que tiene las características de ese gen o producto del gen cuando es aislado de una fuente que ocurre naturalmente. Un gen tipo silvestre es el que se observa con más frecuencia en una población y se diseña así arbitrariamente la forma "normal" o "tipo silvestre" del gen. En contraste, los términos "modificados," "muíante, " y "variante" se refieren a un gen o producto del gen que exhibe modificaciones en secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, características alteradas) cuando es comparado al gen tipo silvestre o producto del gen. Se observa que los mutantes que aparecen naturalmente pueden ser aislados; éstos son identificados por el hecho de que han alterado características cuando se comparan el gen del tipo silvestre o producto del gen. Como se utiliza en la presente, los términos "codificación de la molécula del ácido nucleico," "codificación de la secuencia del ADN," y "codificación del ADN" se refieren al orden o secuencia de deoxirribonucleótidos a lo largo de una hebra del ácido deoxyribonucleico. El orden de estos deoxirribonucleótidos determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena del polipéptido (proteína). En este caso, la secuencia del ADN codifica así la secuencia del aminoácido. Las moléculas del ADN y ARN se dicen que tienen los "extremos 5' " y "los extremos 3' " porque los mononucleótidos se hacen reaccionar para hacer oligonucleótidos o polinucleótidos de una manera tal que el fosfato 5' de un anillo de pentosa del mononucleótido está unido al oxígeno 3' de su vecino en una dirección vía un vínculo del fosfodiéster. Por lo tanto, un extremo del oligonucleótido o polinucleótido, referido como el "extremo 5' " si su fosfato 5' no se liga al oxígeno 3' de un anillo de pentosa del mononucleótido y como el "extremo 3' " si su oxígeno 3' no se liga al fosfato 5' de un anillo subsecuente de pentosa del mononucleótido.

Como se utiliza en la presente, una secuencia del ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido más grande o polinucleótido, también se puede decir que tiene los extremos 5' y 3'. En una molécula lineal o circular de ADN, los elementos discretos son referidos como "corriente arriba" o 5' de los elementos "corriente abajo" o 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción procede de una manera 5' a 3' a lo largo del hebra del ADN. Los elementos promotores y reforzadores que dirigen la transcripción de un gen ligado se localizan generalmente en 5' o corriente arriba de la región de codificación. Sin embargo, los elementos reforzadores pueden ejercer su efecto incluso cuando son localizados en 3' del elemento promotor y de la región de codificación. Las señales de terminación de la transcripción y de la poliadenilación se localizan en 3' o corriente abajo de la región de codificación. Como se utiliza en la presente, los términos "un oligonucleótido que tiene una secuencia del nucleótido que codifica un gen" y "polinucleótido que tiene una secuencia del nucleótido que codifica un gen," significan una secuencia del ácido nucleico que comprende la región de codificación de un gen o, es decir, la secuencia del ácido nucleico que codifica un producto del gen. La región de codificación puede estar presente en un cADN, ADN genómico, o forma de ARN. Cuando está presente en una forma de ADN, el oligonucleótido o polinucleótido puede estar en una sola hebra (es decir, hebra sentido) o en doble-hebra. Los elementos de control adecuados tales como reforzadores/promotores, uniones de liga, señales de poliadenilación, etc. pueden colocarse en proximidad cercana a la región de codificación del gen, si es necesario, para permitir la iniciación apropiada de la transcripción y/o proceso correcto de la transcripción primaria del ARN. Alternativamente, la región de codificación utilizada en los vectores de expresión de la presente invención puede contener reforzadores/promotores endógenos, uniones de liga, secuencias que intervienen, señales de poliadenilación, etc. o una combinación de los elementos de control endógenos y exógenos.

Como se utiliza en la presente, los términos "complementarios" o "complementariedad" se utilizan en referencia a los polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas base-pareamiento. Por ejemplo, para la secuencia "5'-A-G-T-3'," es complementaria a la secuencia "3'-T-C-A-5\" La complementariedad puede ser "parcial," en la cual solamente se igualan algunas de las bases de los ácidos nucleicos de acuerdo con las reglas de apareamiento base. O, puede ser la complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras del ácido nucleico tiene efectos significativos en la eficacia y fuerza de la hibridación entre las hebras del ácido nucleico. Esto es de importancia particular en reacciones de amplificación, así como en los métodos de detección que dependen de la unión entre los ácidos nucleicos. El término "homología" se refiere a un grado de complementariedad. Puede ser homología parcial u homología total (es decir, identidad). Una secuencia parcialmente complementaria es una que inhibe por lo menos parcialmente una secuencia totalmente complementaria de la hibridación a un ácido nucleico objetivo y es referida usando el término funcional "sustancialmente homologa." El término "inhibición de unión," cuando se utiliza en referencia a la unión del ácido nucleico, se refiere a la inhibición de la unión causada por la competición de las secuencias homologas para unirse a una secuencia objetivo. La inhibición de la hibridación de la secuencia totalmente complementaria a la secuencia objetivo se puede examinar usando un ensayo de hibridación (Southern o Northern blot, hibridación de solución y similares) bajo condiciones de severidad baja. Una secuencia o una sonda sustancialmente homologa competirá para e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de un homólogo totalmente a un objetivo bajo condiciones de severidad baja. Esto no quiere decir que las condiciones de severidad baja son tal que la unión no específica está permitida; las condiciones de baja severidad requieren que la unión de dos secuencias a otra sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de la unión no específica se puede probar por el uso de un segundo objetivo que carezca incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente 30% de identidad); en ausencia de la unión no específica la sonda no se someterá a hibridación al segundo objetivo no-complementario. La técnica conoce bien que las condiciones equivalentes numerosas se pueden emplear para que comprendan las condiciones de baja severidad; factores tales como la longitud y naturaleza (ADN, ARN, composición base) de la sonda y naturaleza del objetivo (ADN, ARN, composición base, presentes en la solución o inmovilizados, etc.) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano, polietilenglicol) se considera y la solución de hibridación se puede variar para generar condiciones de hibridación de baja severidad diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones arriba enumeradas. Además, la técnica conoce las condiciones que promueven la hibridación bajo condiciones de alta severidad (por ejemplo, aumentando la temperatura de las etapas de hibridación y/o de lavado, el uso de formamida en la solución de hibridación, etc.). Cuando se utiliza en referencia a una secuencia del ácido nucleico de doble hebra tal como un cADN o clon genómico, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que pueda hibridizar en cualquiera o ambas hebras de la secuencia del ácido nucleico de doble hebra bajo condiciones de severidad baja de acuerdo con lo descrito arriba. Un gen puede producir especies múltiples de ARN que son generadas por el liga diferencial de la transcripción primaria del ARN. cADNs que son variantes de liga del mismo gen contendrán regiones de la identidad de secuencia u homología completa (que representa la presencia el mismo exón o porción del mismo exón en cADNs) y las regiones de identidad no completa (por ejemplo, representando la presencia del exón "A" en cADN 1 en donde cADN 2 contiene el exón "B" en lugar de otro). Debido a que los dos cADNs contienen regiones de identidad de secuencia ambos hibridazarán a una sonda derivada del gen entero o porciones del gen que contienen las secuencias encontradas en ambos cADNs; las dos variantes de liga son por lo tanto sustancialmente homologas a tal sonda y entre sí. Cuando es utilizado en referencia a una secuencia del ácido nucleico de una sola hebra, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que pueda hibridizar (es decir, es el complemento de) la secuencia del ácido nucleico de una sola hebra bajo condiciones de severidad baja de acuerdo con lo descrito arriba. Como se utiliza en la presente, el término "hibridación" se utiliza en referencia al apareamiento de los ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de la asociación entre los ácidos nucleicos) son afectadas por los factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, severidad de las condiciones implicadas, la Tm del híbrido formado, y la relación G:C dentro de los ácidos nucleicos. Como se utiliza en la presente, el término "Tm" se utiliza con referencia a la "temperatura de fusión". La temperatura de fusión es la temperatura en la cual una población de moléculas del ácido nucleico de doble hebra, se convierte en la mitad disociada en hebras solas. La ecuación para calcular la Tm de ácidos nucleicos es bien conocida en la técnica. Como se indica por referencias estándares, una estimación simple del valor de Tm se puede calcular por la ecuación: Tm = 81.5 + 0.41(% G + C), cuando un ácido nucleico está en la solución acuosa a 1M NaCI (ver por ejemplo, Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, en Nucleic Acid Hybridization

[1985]). Otras referencias incluyen cómputos más sofisticados que toman las características estructurales así como de la secuencia en cuenta para el cálculo de Tm. Como se utiliza en la presente el término "severidad" se utiliza en referencia a las condiciones de temperatura, fuerza iónica, y la presencia de otros compuestos tales como solventes orgánicos, bajo los cuales se conducen las hibridaciones del ácido nucleico. Los expertos en la técnica reconocerán que las condiciones de "severidad" se pueden alterar variando los parámetros justo descritos ya sea individualmente o en concierto. Con condiciones de "alta severidad", el apareamiento base del ácido nucleico ocurrirá solamente entre los fragmentos del ácido nucleico que tienen una frecuencia alta de secuencias base complementarias (por ejemplo, la hibridación bajo condiciones de "alta severidad" puede ocurrir entre los homologs con aproximadamene 85-100% de identidad, preferiblemente con identidad de aproximadamente 70-100%). Con condiciones de media severidad, el apareamiento base del ácido nucleico ocurrirá entre los ácidos nucleicos con una frecuencia intermedia de secuencias base complementarias (por ejemplo, la hibridación bajo condiciones de "severidad media" puede ocurrir entre los homólogos con una identidad de aproximadamente 50-70%). Así, las condiciones de severidad "débil" o "baja" se requieren frecuentemente con los ácidos nucleicos que se derivan de organismos que son genéticamente diversos, pues la frecuencia de secuencias complementarias es generalmente menor. "Condiciones de alta severidad" cuando se utiliza en referencia a la hibridación del ácido nucleico, comprende las condiciones equivalentes para unir o hibridizar a 42°C en una solución que consiste de 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2P04H20 y 1.85 g/l EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), 0.5% de SDS, reactivo de 5X Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguido por lavado en una solución que comprende 0.1X SSPE, 1.0% SDS a 42°C cuando una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud se emplea. "Condiciones de severidad media" cuando se utiliza en referencia a la hibridación del ácido nucleico, comprende las condiciones equivalentes a unir o hibridizar a 42°C en una solución que consiste de 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2P04H20 y 1,85 g/l EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), 0,5% de SDS, reactivo de 5X Denhardt y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado en una solución que comprende 1.0X SSPE, 1.0% SDS a 42°C cuando una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud se emplea. "Condiciones de baja severidad" comprenden las condiciones equivalentes para unir o hibridizar a 42°C en una solución que consiste de 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2P04H20 y 1.85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), 0.1% SDS, reactivo de 5X Denhardt [contiene 50X Denhardt por 500 mi: 5 g Ficoll (tipo 400, Pharamcia), 5 g BSA (fracción V; Sigma)] y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado en una solución que comprende 5X SSPE, 0.1% SDS a 42°C cuando la sonda de de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud se emplea. Los términos siguientes se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia," "identidad de secuencia," "porcentaje de la identidad de secuencia," e "identidad sustancial." Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como base para una comparación de secuencia; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de longitud completa de cADN dada en un listado de secuencias o puede comprender una secuencia completa del gene. Generalmente, una secuencia de referencia es por lo menos de 20 nucleótidos en longitud, con frecuencia por lo menos 25 nucleótidos en longitud, y frecuentemente por lo menos 50 nucleótidos en longitud. Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa del polinucleótido) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) puede además comprender una secuencia que sea divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos son realizadas típicamente comparando las secuencias de dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de la similaridad de secuencia. Una "ventana de comparación," como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 20 posiciones contiguas del nucleótido en donde una secuencia del polinucleótido se puede comparar a una secuencia de referencia de por lo menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la porción de la secuencia del polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones(es decir, espacios) de 20 por ciento o menos con respecto a la secuencia de referencia (que no comprenden adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación se puede conducir por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)] por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], por la búsqueda por el método de similaridad de Pearson and Lipman [Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci (U.S. A) 85:2444 (1988)], por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por la inspección, y l mejor alineación (es decir, resultando en el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por los varios métodos, se selecciona. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias del polinucleótido son idénticas (es decir, en una base de nucleótido-por-nucleótido) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" es calculado comparando dos secuencias óptimas alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base idéntica del ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U, ó I) ocurre en ambas secuencias para rendir el número de posiciones igualadas, dividiendo el número de posiciones igualadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para rendir el porcentaje de la identidad de secuencia. En relación a polinucleótidos, el término "identidad sustancial" denota una característica de una secuencia del polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más generalmente por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 20 posiciones del nucleótido, con frecuencia sobre una ventana de por lo menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia es calculado comparando la secuencia de referencia a la secuencia del polinucleótido que puede incluir eliminaciones o adiciones que suman 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como variante de liga de las secuencias de longitud completa. En relación a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando son alineadas de forma óptima, por ejemplo por los programas GAP o BESTFIT usando los pesos del espacio predeterminados, parte de por lo menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99 por ciento de identidad de secuencia). Preferiblemente, las posiciones del residuo que no son idénticas difieren por las sustituciones conservadoras del aminoácido. Las sustituciones conservadoras del aminoácido se refieren a la capacidad de intercambio de los residuos que tienene cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofan; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es Usina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales con sulfuro es cisteina y metionina. Los grupos de substitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, y asparagina-glutamina. "Amplificación" es un caso especial de la replicación del ácido nucleico que implica la especificidad del patrón. Debe ser puesta en contraste con la replicación no específica del patrón (es decir, la replicación que es dependiente del patrón pero no dependiente de un patrón específico). La especificidad de patrón aquí se distingue de la fidelidad de replicación (es decir, síntesis de la secuencia apropiada del polinucleótido) y especificidad del nucleótido (ribo- o deoxiribo-). La especificidad de patrón se describe con frecuencia en términos de especificidad del "objetivo". Las secuencias objetivo son "objetivos" en el sentido que se buscan para clasificarse fuera del otro ácido nucleico. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta clasificación. La especificidad de patrón es alcanzada en la mayoría de las técnicas de amplificación por la opción de la enzima. Las enzimas de amplificación son enzimas que, bajo condiciones que ellas utilizan, procesarán solamente secuencias específicas del ácido nucleico en una mezcla heterogénea del ácido nucleico. Por ejemplo, en el caso de la replicasa Q, MDV-1 ARN es el patrón específico para la replicasa (D.L. Kacian y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 69:3038

[1972]). El otro ácido nucleico no será replicado por esta enzima de amplificación. Similarmente, en el caso de la polimerasa T7 ARN, esta enzima de amplificación tiene una especificidad rigurosa para sus propios promotores (M. Chamberlin y colaboradores, Nature 228:227

[1970]). En el caso de la ligasa T4 ADN, la enzima no ligará los dos oligonucleótidos o polinucleótidos, donde hay una desigualdad entre el sustrato del oligonucleótido o polinucleótido y el patrón en la unión de la ligadura (D.Y. Wu y R. B. Wallace, Genomics 4:560

[1989]). Finalmente, las polimerasas Taq y Pfu, en virtud de su capacidad de funcionar a temperatura alta, se encontró que exhiben especificidad alta para las secuencias unidas y definidas así por los cebadores; la temperatura alta da lugar a condiciones termodinámicas que favorecen la hibridación del cebador con las secuencias objetivo y no a la hibridación con las secuencias no-objetivo (H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press

[1989]). Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico amplificable" se utiliza en referencia a los ácidos nucleicos que se pueden amplificar por cualquier método de amplificación. Se contempla que el "ácido nucleico amplificable" comprenderá generalmente el "patrón muestra." Como se utiliza en la presente, el término "patrón muestra" se refiere al ácido nucleico que se origina de una muestra que se analiza para la presencia del "objetivo" (definido abajo). En contraste, "patrón de fondo" se utiliza en referencia al ácido nucleico distinto del patrón muestra que puede o no puede estar presente en una muestra. El. patrón de fondo es frecuentemente inadvertido. Puede ser el resultado del restante, o puede ser debido a la presencia de contaminantes del ácido nucleico buscados para purificarse lejos de la muestra. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de organismos distintos a los que se detectarán pueden estar presentes como fondo en una muestra de sonda. Como se utiliza en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, si ocurre naturalmente como en una digestión de restricción purificada o producido de manera sintética, que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando es colocado bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a un hebra del ácido nucleico, se induzca, (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como polimerasa de ADN y a una temperatura y pH adecuados). El cabador es preferiblemente de una sola hebra para la eficiencia máxima en la amplificación, pero puede alternativamente ser de doble hebra. Si el cabador de doble hebra, primero se trata para separar sus hebras antes de ser utilizado para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cabador es un oligodeoxirribonucleótido. El cabador debe ser suficientemente largo para preparar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente del cebador y uso del método. Como se utiliza en la presente, el término "sonda" o "sonda de hibridación" se refiere a un oligonucleótido (es decir, una secuencia de nucleótidos), si ocurre naturalmente como en una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, de manera recombinante o por la amplificación de PCR, que es capaz de hibridación, por lo menos en parte, a otro oligonucleótido de interés.

Una sonda puede ser de una sola hebra o de doble hebra. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias particulares. En algunas modalidades preferidas, las sondas usadas en la presente invención serán marcadas con una "molécula reportero," de modo que sea detectable en cualquier sistema de detección, incluyendo, pero no limitado a sistemas de enzima (por ejemplo, ELISA, así como los ensayo histoquímicos basados en enzima), fluorescentes, radiactivos, y luminiscentes. No se desea que la presente invención se limite a cualquier sistema particular de detección o etiqueta. Como se utiliza en la presente, el término "objetivo" se refiere a una secuencia del ácido nucleico o estructura que es caracterizada o que se detectará. Como se utiliza en la presente, el término "reacción de la cadena de polimerasa "("PCR") se refiere al método de K.B. Mullís (ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4.683.195, 4.683.202, y 4.965.188, incorporadas por este medio por referencia), que describe un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin la clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia objetivo consiste en introducir un exceso grande de dos cebadores del oligonucleótido a la mezcla de ADN que contiene la secuencia deseada objetivo, seguido por una secuencia exacta de ciclo térmico en presencia de una polimerasa del ADN. Los dos cebadores son complementarios a sus hebras respectivas de la secuencia de hebra doble objetivo. Para efectuar la amplificación, la mezcla se desnaturaliza y los cebadores después se templan a sus secuencias complementarias dentro de la molécula objetivo. Después del templado, los cebadores se amplían con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, templado del cebador, y extensión de polimerasa puede ser repetidas muchas veces, (es decir, desnaturalización, templado y extensión constituyen un "ciclo"; puede haber "ciclos numerosos") para obtener una concentración alta de un segmento amplificado de la secuencia deseada objetivo. La longitud del segmento amplificado de la secuencia deseada objetivo es determinada por las posiciones relativas de los cebadores entre sí, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del proceso, el método es referido como "la reacción de la cadena de polimerasa" (más abajo "PCR"). Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia objetivo se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, serían "PCR amplificada." Con la PCR, es posible amplificar una sola copia de una secuencia específica objetivo en el ADN genómico a un nivel detectable por diversas metodologías (es decir, hibridación con una sonda etiquetada; incorporación de cebadores biotinilados seguido por la detección de conjugación de la avidina-enzima; incorporación de trifosfatos del deoxinucleótido 32P-etiquetados, tales como dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Además del ADN genómico, cualquier secuencia del oligonucleótido o polinucleótido se puede amplificar con el sistema apropiado de moléculas cebadoras. En particular, los segmentos amplificados creados por el proceso por sí mismo de PCR son, por ellos mismos, patrones eficientes para las amplificaciones subsecuentes de PCR.

Como se utiliza en la presente, los términos "producto de PCR," "fragmento de PCR," y "producto de amplificación" se refieren a la mezcla resultante de compuestos después que dos o más ciclos de las etapas de PCR de desnaturalización, templado y extensión se completen. Estos términos comprenden el caso donde ha habido la amplificación de uno o más segmentos de una o más secuencias objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "reactivo de amplificación" se refiere a los reactivos (trifosfatos del deoxirribonucleótido, amortiguador, etc.), necesarios para la amplificación a excepción de los cebadores, patrón del ácido nucleico, y enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción se colocan y se contienen en un recipiente de reacción (tubo de sonda, micropozo, etc.). Como se utiliza en la presente, el término "recipiente de reacción" se refiere a un sistema en el cual una reacción pueda ser conducida, incluyendo pero no limitado a tubos de sonda, pozos, micropozos (por ejemplo, pozos en placas de ensayo de microtítulo por ejemplo, de 96-pozos, 384-pozos y placas de ensayo 1536-pozos), tubos capilares, extremos de fibras tales como fibras ópticas, dispositivos microfluídicos tales como chips, cartuchos y tarjetas fluídicos (incluyendo pero no limitado a las descritas, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6.126.899 de Woudenberg, y colaboradores, Patentes Norteamericanas Nos. 6.627.159, 6.720.187, y 6.734.401 de Bedingham, y colaboradores, Patente Norteamericana No. 6.319.469 y 6.709.869 de Mian, y colaboradores, las Patentes Norteamericanas Nos. 5.587.128 y 6.660.517 de Wilding, y colaboradores.), o un sitio de prueba en cualquier superficie (incluyendo pero no limitado a un vidrio, plástico o superficie de silicio, un grano, microchip, o una superficie no-sólida, por ejemplo como un gel o dendrímero). Como se utiliza en la presente, el término "molécula de ADN recombinante" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de ADN que está comprendida de segmentos de ADN unidos juntos por medio de técnicas biológicas moleculares. Como se utiliza en la presente, el término "antisentido" se utiliza en referencia a las secuencias del ARN que son complementarias a una secuencia específica del ARN (por ejemplo, mARN). El término "hebra del antisentido" se utiliza en referencia a un hebra del ácido nucleico que sea complementaria a la hebra del "sentido". La designación (-) (es decir, "negativa") se utiliza a veces en referencia a la hebra del antisentido, con la designación (+) usada a veces en referencia a la hebra del sentido (es decir, "positiva"). El término "aislado" cuando se utiliza en relación a un ácido nucleico, como en "un oligonucleótido aislado" o "polinucleótido aislado", se refiere a una secuencia del ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos un ácido nucleico del contaminante al cual se asocia ordinariamente en su fuente natural.

El ácido nucleico aislado está presente en una forma o ambiente que es diferente del que se encuentra en la naturaleza. En contraste, los ácidos nucleicos sin aislar son ácidos nucleicos tales como el ADN y el ARN encontrados en el estado que existen en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gene) se encuentra en el cromosoma de la célula hospedadora en proximidad a los genes vecinos; las secuencias del ARN, tales como una secuencia específica de mARN que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con numerosos otros mARNs que codifiquen una multiplicidad de proteínas. Sin embargo, los ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido incluyen, a modo de ejemplo, tal ácido nucleico en las células que expresan ordinariamente el polipéptido donde está el ácido nucleico en una localización cromosómica diferente de la de células naturales, o son flanqueados de otra manera por una diversa secuencia del ácido nucleico que la que se encuentra en la naturaleza. El ácido nucleico, oligonucleótido, o polinucleótido aislados pueden estar presentes en forma de una sola hebra o doble hebra. Cuando un ácido nucleico, oligonucleótido o polinucleótido aislado debe ser utilizado para expresar una proteína, el oligonucleótido o polinucleótido contendrá en un mínimo la hebra del sentido o de codificación (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de una sola-hebra), pero puede contener hebras de sentido y anti-sentido (es decir, el oligonucleótido o polinucleótido puede ser de doble hebra). Como se utiliza en la presente, el término "porción" cuando es en referencia a una una secuencia del nucleótido (como en "una porción de una secuencia del nucleótido dada") se refiere a fragmentos de esa secuencia. Los fragmentos pueden extenderse de tamaño a partir de cuatro nucleótidos a la secuencia entera del nucleótido menos un nucleótido (por ejemplo, 10 nucleótidos, 11,... 20,...). Como se utiliza en la presente, el término "purificado" o "purificar" se refiere al retiro de contaminantes de una muestra. Como se utiliza en la presente, el término "purificado" se refiere a las moléculas (por ejemplo, las secuencias nucleicas o del aminoácido) que se eliminan de su ambiente natural, se aislan o se separan. Una " secuencia del ácido nucleico aislada" es por lo tanto una secuencia purificada del ácido nucleico. Moléculas "sustancialmente purificadas" son por lo menos 60% libres, preferiblemente por lo menos 75% libres, y más preferiblemente por lo menos 90% libres de otros componentes con los cuales están naturalmente asociadas. El término "proteína recombinante" o "polipéptido recombinante" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de proteína que se expresa de una molécula de ADN recombinante. El término "proteína nativa" como se utiliza en la presente indica que una proteína no contiene residuos de aminoácido codificados por secuencias del vector; es decir, la proteína nativa contiene solamente los aminoácidos encontrados en la proteína como ocurre en naturaleza. Una proteína nativa se puede producir por medios recombinantes o se puede aislar de una fuente que ocurre naturalmente. Como se utiliza en la presente el término "porción" cuando es en referencia a una proteína (como en "una porción de una proteína dada") se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden ir en tamaño de cuatro residuos consecutivos del aminoácido • a la secuencia entera del aminoácido menos un aminoácido. El término "Southern blot," se refiere al análisis del ADN en geles de agarosa o acrilamida para fraccionar el ADN de acuerdo con el tamaño seguido por la transferencia del ADN desde el gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o una membrana de nylon. El ADN inmovilizado entonces se sondea con una sonda etiquetada para detectar la especie del ADN complementaria a la sonda usada. El ADN se puede dividir con las enzimas de restricción antes de la electrofóresis. Después de la electrofóresis, el ADN puede ser despurificado y desnaturalizado parcialmente antes o durante la transferencia al soporte sólido. Los análisis de Southern blot son una herramienta estándar de los biólogos moleculares (J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58

[1989]). El término "Western blot" se refiere al análisis de proteínas (o polipéptidos) inmovilizadas sobre u? soporte tal como nitrocelulosa o una membrana. Las proteínas se ejecutan en geles de acrilamida para separar las proteínas, seguido por la transferencia de la proteína desde el gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o una membrana de nylon. Las proteínas inmovilizadas entonces se exponen a los anticuerpos con reactividad contra un antígeno de interés. La unión de los anticuerpos se puede detectar por varios métodos, incluyendo el uso de anticuerpos etiquetados. El término "compuesto de prueba" se refiere a cualquier entidad química, farmacéutico, fármaco, y similares que se prueban en un ensayo (por ejemplo, un ensayo de análisis del fármaco) para cualquier actividad deseada (por ejemplo, incluyendo pero no limitado a, la capacidad de tratar o prevenir una enfermedad, transtorno, condición, o desorden de la función corporal, o si no alterar el estado fisiológico o celular de una muestra). Los compuestos de prueba comprenden los compuestos terapéuticos conocidos y potenciales. Un compuesto de prueba se puede determinar que es terapéutico por la clasificación usando los métodos de clasificación de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" se refiere a un compuesto terapéutico que ha demostrado (por ejemplo, a través de ensayos con animales o en la experiencia anterior con la administración a los humanos) ser eficaz en tal tratamiento o prevención. El término "muestra" como se utiliza en la presente se utiliza en su sentido más amplio. Una muestra sospechada de contener un cromosoma humano o secuencias asociadas a un cromosoma humano puede comprender una célula, cromosomas aislados de una célula (por ejemplo, una expansión de ios cromosomas de metafase), el • ADN genómico (en la solución o unión a un soporte sólido tal como para el análisis de Southern blot), el ARN (en la solución o unido a un soporte sólido tal como para el análisis de Northern blot), cADN (en la solución o unido a un soporte sólido) y similares. Una muestra sospechada de contener una proteína puede comprender una célula, una porción de un tejido, un extracto que contiene una o más proteínas y similares. Las muestras incluyen, pero no se limitan a, secciones del tejido, sangre, fracciones de sangre (por ejemplo suero, plasma, células), saliva, fluido espinal cerebral, fluido pleural, leche, linfa, esputo, semen, orina, heces, fluido amniótico, muestras de villus crónico (CVS), algodones cervicales y algodones bucales. El término "etiqueta" de acuerdo con lo a utilizado adjunto se refiere a cualquier átomo o molécula que se pueda utilizar para proporcionar un efecto (preferiblemente cuantificable) detectable, y que se pueda unir a un ácido nucleico o proteína. Las etiquetas incluyen pero no se limitan a tintes; radioetiquetas tales como 2P; fracciones de unión tales como biotina; haptenos tales como digoxgenin; fracciones luminogénicas, fosforescentes o fluorogénicas; y tintes fluorescentes solos o en combinación con fracciones que pueden suprimir o cambiar los espectros de la emisión por la transferencia de energía de la resonancia de fluorescencia (FRET). Las etiquetas pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo, actividad enzimática, y similares. Una etiqueta puede ser una fracción cargada (carga positiva o negativa) o alternativamente, puede ser de carga neutral. Las etiquetas pueden incluir o consistir de la secuencia del ácido nucleico o de la proteína, siempre y cuando la secuencia que comprende la etiqueta sea detectable. El término "señal" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier efecto detectable, por ejemplo causado o proporcionado por una etiqueta o una reacción del ensayo. Como se utiliza en la presente, el término "detector" se refiere a un sistema o componente de un sistema, por ejemplo, un instrumento (por ejemplo una cámara, fluorímetro, un dispositivo acoplado de carga, un contador de centelleo, etc) o un medio reactivo (radiografía o película de cámara, indicador de pH, etc.), que puede transportar a un usuario o a otro componente de un sistema (por ejemplo, una computadora o controlador) la presencia una señal o efecto. Un detector puede ser un sistema fotométrico o espectrofotométrico, que puede detectar luz ultravioleta, visible o infrarroja, incluyendo fluorescencia o quimioluminescencia; un sistema de detección por radiación; un sistema espectroscópico tal como espectroscopia de resonancia magnética nuclear, espectrometría de masa o espectrometría de Raman mejorada de superficie; un sistema tal como electrofóresis de gel o tubo capilar o cromatografía de exclusión del gel; u otro sistema de detección conocido en la técnica, o combinaciones de los mismos. Como se utiliza en la presente, el término "sistema de distribución" se refiere a los sistemas capaces de transferir y/o de suministrar materiales de una entidad a otra o una localización a otra. Por ejemplo, un sistema de distribución para la transferencia de paneles de detección de un fabricante o distribuidor a un usuario puede comprender, pero no limitado a, un departamento de empaquetado, cuarto de envió, y un sistema de reparto del correo.

Alternativamente, el sistema de distribución puede comprender, pero no limitado a, uno o más vehículos de entrega y personal asociado de entrega, un estante de exhibición, y un centro de distribución. En algunas modalidades de la presente invención las partes interesadas (por ejemplo, los fabricantes del panel de detección) utilizan un sistema de distribución para transferir paneles de detección a los usuarios sin ningún costo, en un costo subsidiado, o a un costo reducido. Como se utiliza en la presente, el término "en un costo reducido" se refiere a la transferencia de mercancías o servicios a un costo directo reducido al recipiente (por ejemplo usuario). En algunas modalidades, "a un costo reducido" se refiere a la transferencia mercancías o servicios sin ningún costo al receptor. Como se utiliza en la presente, el término "en un costo subsidiado" se refiere a la transferencia de mercancías o servicios, en donde por lo menos una porción del costo del recipiente es diferida o pagada en parte. En algunas modalidades, "a un costo subsidiado" se refiere a la transferencia of mercancías o servicios a ningún costo para el receptor. De acuerdo a lo utilizado adjunto, el término "a ningún costo" se refiere a la transferencia de mercancías o servicios sin cargo directo financiero al receptor. Por ejemplo, cuando los paneles de detección son proporcionados por un fabricante o distribuidor a un usuario (por ejemplo, científico de investigación) a ningún costo, el usuario no paga directamente las pruebas. El término "detección" como se utiliza en la presente, se refiere identificar cuantitativa o cualitativamente un analito (por ejemplo, ADN, ARN o una proteína) dentro de una muestra. El término "ensayo de detección" como se utiliza en la presente se refiere a un kit, prueba, o a un procedimiento realizado con el fin de detectar un ácido nucleico del analito dentro de una muestra. Los ensayos de detección producen una señal o efecto detectable cuando se realizan en presencia del analito objetivo, e incluyen pero no se limitan a los ensayos que incorporan los procesos de hibridación, división del ácido nucleico (por ejemplo, exo- o endonucleasa), amplificación del ácido nucleico, secuenciación del nucleótido, extensión del cebador, o ligadura del ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido de detección funcional" se refiere a un oligonucleótido que se utiliza como componente de un ensayo de detección, en donde el ensayo de detección es capaz con éxito de detectar (es decir, produciendo una señal detectable) un ácido nucleico previsto objetivo cuando el oligonucleótido de detección funcional proporciona el componente del oligonucleótido del ensayo de detección. Esto es en contraste a los oligonucleótidos de detección no funcionales, que no pueden producir una señal detectable en un ensayo de detección para el ácido nucleico objetivo particular cuando el oligonucleótido de detección no funcional se proporciona como el componente del oligonucleótido del ensayo de detección. La determinación si un oligonucleótido es un oligonucleótido funcional puede ser realizada experimentalmente probando el oligonucleótido en presencia del ácido nucleico objetivo particular usando el ensayo de detección. Como se utiliza en la presente, el término "derivado de un sujeto diferente," tal como muestras o ácidos nucleicos derivados de diferentes sujetos, se refiere a las muestras derivadas de diferentes individuos múltiples. Por ejemplo, una muestra de sangre que comprende ADN genómico de una primera persona y una muestra de sangre que comprende el ADN genómico de una segunda persona se consideran muestras de sangre y muestras del ADN genómico que se derivan de diferentes sujetos. Una muestra que comprende cinco ácidos nucleicos objetivo derivados de diferentes sujetos es una muestra que incluye por lo menos cinco muestras de cinco diferentes individuos. Sin embargo, la muestra puede contener además muestras múltiples de un individuo dado. Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento junto", cuando es utilizado en referencia los experimentos o ensayos, se refiere a conducir experimentos concurrentemente o secuencialmente, en donde los resultados de los experimentos se producen, se recolectan, o se analizan juntos (es decir, durante el mismo período). Por ejemplo, una pluralidad de diversas secuencias objetivo situadas en pozos separados de una placa de multipozos o en diversas porciones de un microarreglo, se tratan juntas en un ensayo de detección donde las reacciones de detección se realizan en las muestras simultáneamente o secuencialmente y donde los datos recolectados de los ensayo, se analizan juntos. Los términos "datos de ensayo" y "datos del resultado de prueba" como es utilizado adjunto se refiere a los datos recogidos de la ejecución de un ensayo (por ejemplo, detectar o cuantificar un gen, SNP o un ARN). Los datos del resultado de la prueba pueden estar en cualquier forma, es decir, puede ser datos de ensayo sin analizar o datos de ensayo analizados (por ejemplo, analizados previamente por un diferente proceso). Los datos recogidos que no se han procesado o no se han analizado adicionalmente son referidos adjunto como datos "sin analizar" del ensayo (por ejemplo, un número correspondiene a una medida de señal, tal como una señal de fluorescencia de un punto en un chip o un recipiente de reacción, o un número que corresponde a la medida de un pico, tal como altura máxima o área, como desde, por ejemplo, un espectrómetro de masas, HPLC o un dispositivo de separación capilar), mientras que los datos del ensayo que se han procesado a través de una etapa o análisis (por ejemplo, normalizado, comparado, o si no procesado por un cálculo) son referidos como "datos analizados de ensayo" o "datos de ensayo de salida". Como se utiliza en la presente, el término "base de datos" se refiere a colecciones de información (por ejemplo, datos) dispuestas para facilidad de recuperación, por ejemplo, almacenadas en una memoria de computadora. Una "base de datos de información genómica" es una base de datos que comprende información genómica, incluyendo, pero no limitado a, información del polimorfismo (es decir, información que pertenece a polimorfismos genéticos), información del genoma (es decir, información genómica), información de enlace (es decir, información que pertenece a la localización física de una secuencia del ácido nucleico con respecto a otra secuencia del ácido nucleico, por ejemplo, en un cromosoma), y la información de asociación de la enfermedad (es decir, información que correlaciona la presencia de o susceptibilidad a una enfermedad a un rasgo físico de un sujeto, por ejemplo, un alelo de un sujeto). La "información de la base de datos" se refiere a la información que se enviará a las bases de datos, almacenada en una base de datos, procesada en una base de datos, o recuperada de una base de datos. "La información de la base de datos de la secuencia" se refiere a la información de la base de datos que pertenece a las secuencias del ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, el término "bases de datos de secuencia distintas" se refiere a dos o más bases de datos que contengan diversa información una de la otra. Por ejemplo, dbSNP y las bases de datos de GenBank son bases de datos de secuencia distintas porque cada una contiene información no encontrada en la otra. Como se utiliza en la presente, los términos "procesador" y "unidad de procesamiento central" o "CPU" se utilizan alternativamente y se refieren a un dispositivo que pueda leer un programa de la memoria de computadora (por ejemplo, la ROM u otra memoria de computadora) y realizar un juego de etapas de acuerdo con el programa. Como se utiliza en la presente, los términos "memoria de computadora" y "dispositivo de memoria de computadora" se refieren a cualquier medio de almacenaje legible por. un procesador de computadora. Los ejemplos de la memoria de computadora incluyen, pero no se limitan a, RAM, ROM, chips de computadora, disco de video digital (DVDs), discos compactos (CDs), unidades de disco duro (HDD), y cinta magnética. Como se utiliza en la presente, el término "medio legible por computadora" se refiere a cualquier dispositivo o sistema para almacenar y proporcionar información (por ejemplo datos e instrucciones) a un procesador de computadora. Los ejemplos de medios legibles por computadora incluyen, pero no se limitan a, DVDs, CDs, unidades de disco duro, cinta magnética y servidores para redes sobre medios fluyentes. Como se utiliza en la presente, el término "hipervínculo" se refiere a un vínculo navegacional de un documento a otro, o de una porción (o componente) de un documento a otra. Típicamente, un hipervínculo se exhibe como palabra o frase destacada que puede ser seleccionada presionando sobre ella usando un ratón para saltar el documento asociado o porción documentada. Como se utiliza en la presente, el término "sistema de hipertexto" se refiere a un sistema informativo computarizado en el cual los documentos (y posiblemente otros tipos de entidades de datos) se liguen juntos vía hipervínculos para formar una "red" de usuario-navegable. Como se utiliza en la presente, el término "Internet" se refiere a cualquier colección de redes que usan protocolos estándares. Por ejemplo, el término incluye una colección de redes (públicas y/o privadas) interconectadas que son ligadas juntas por un sistema de protocolos estándares (tales como TCP/IP, HTTP, y FTP) para formar una red global, distribuida. Mientras que este término se desea para referirse a lo que ahora se conoce comúnmente como la Internet, también se desea para que comprenda las variaciones que se pueden hacer en el futuro, incluyendo cambios y adiciones a los protocolos estándares existentes o integración con otros medios (por ejemplo, televisión, radio, etc). El término también se desea para que comprenda redes non-públicas tales como (por ejemplo, corporativo) Intranets privados. Como se utiliza en la presente, los términos "World Wide Web" o "red" son referidos generalmente como (i) una colección distribuida de documentos de hipertexto visibles por el usuario, interligados (referidos comúnmente como documentos de la red o páginas de la red) que son accesibles vía la Internet, y (ii) los componentes de software del servidor y del cliente que proporcionan el acceso al usuario a tales documentos usan protocolos estandardizados de la Internet. Actualmente, el protocolo estándar primario para permitir las aplicaciones de localizar y adquirir documentos de red es HTTP, y se codifican las páginas de la red usando HTML. Sin embargo, los términos "Red " y "World Wide Web" se desean que comprendan los lenguajes de marcado futuros y los protocolos de transporte que se pueden utilizar (o además de) HTML y HTTP. Como se utiliza en la presente, el término "Sitio de red" se refiere a un sistema informático que sirve el contenido informativo sobre una red usando los protocolos estándares de la World Wide Web. Normalmente, un sitio de red corresponde a un dominio particular de Internet e incluye el contenido asociado a una organización particular. Como se utiliza en la presente, el término se desea generalmente para comprender (i) los componentes del servidor del hardware/software que sirven el contenido informativo sobre la red, y (ii) los componentes del hardware/software "secundarios", incluyendo cualquier componente no estándar o especializado, que interactúa con los componentes del servidor para realizar los servicios para los usuarios del sitio de red. Como se utiliza en la presente, el término "HTML" se refiere a HyperText Markup Lenguage que es. una convención de codificación estándar y grupo de códigos para unir la presentación y ligar los atributos al contenido informativo dentro de documentos. El HTML se basa en SGML, el Standard Generalized Markup Lenguage. Durante la etapa de autor del documento, los códigos de HTML (referidos como "marcas") se incorporan dentro del contenido informativo del documento. Cuando el documento de la red (o el documento de HTML) se transfiere posteriormente de un servidor de red a un Navegador, los códigos son interpretados por el Navegador y utilizados para analizar y exhibir el documento. Además, al especificar cómo el Navegador de red exhibe el documento, las etiquetas de HTML se pueden utilizar para crear vínculos a otros documentos de la red (designados comúnmente como "hipervínculos"). Como se utiliza en la presente, el término "XML" se refiere al Extensible Markup Language, un perfil de aplicación que, como el HTML, se basa en SGML. XML difiere de HTML en que: los proveedores de información pueden definir nuevos nombres de etiqueta y atributos a voluntad; las estructuras del documento se pueden jerarquizar a cualquier nivel de complejidad; cualquier documento de XML puede contener una descripción opcional de su gramática por la aplicación que necesitan realizar la validación estructural. Los documentos de XML se componen de entidades llamadas unidades de almacenaje, que contienen datos analizados o no analizados. Los datos analizados se componen de caracteres, algunos de los cuales forman datos del carácter, y algunos de los cuales forman el marcado. El marcado codifica una descripción la disposición del almacenaje del documento y estructura lógica. XML proporciona un mecanismo para imponer restricciones en la disposición de almacenaje y estructura lógica, para definir restricciones en la estructura lógica y para soportar el uso de unidades predefinidas de almacenaje. Un módulo de software llamado un procesador de XML se utiliza para leer documentos XML y para proporcionar el acceso a su contenido y estructura. Como se utiliza en la presente, el término "HTTP" se refiere al Hypertext Transport Protocol que es el protocolo estándar del servidor a cliente de la World Wide Web usado para el intercambio de información (tal como documentos de HTML, y las peticiones del cliente para tales documentos) entre un Navegador y un servidor de red. El HTTP incluye un número de diferentes tipos de mensajes que se pueden enviar del cliente al servidor para solicitar diferentes tipos de acciones del servidor. Por ejemplo, un mensaje "GET", que tiene el formato GET, causa que el servidor regrese el documento o archivo situado en el URL especificado Como se utiliza en la presente, el término "URL" se refiere al Uniform Resource Locator que es una dirección única que especifica completamente la localización de un archivo u otro recurso en Internet. El formato general de un URL es protocol://machine address:port/path/filename. La especificación portuaria es opcional, y si no se incorpora ninguna por el usuario, el Navegador omite el puerto estándar para cualquier servicio que se especifica como el protocolo. Por ejemplo, si HTTP se especifica como el protocolo, el Navegador utilizará el puerto predeterminado de HTTP de 80. Como se utiliza en la presente, el término "tecnología de PUSH" se refiere a una tecnología de difusión de información usada para enviar datos a los usuarios sobre una red. En contraste con la World Wide Web (una tecnología de "tirón"), en el cual el navegador del cliente debe solicitar una página de red antes de que se envíe, los protocolos de PUSH envían el contenido informativo a la computadora del usuario automáticamente, basado típicamente en la información especificada primero por el usuario. Como se utiliza en la presente, el término "red de comunicaciones" se refiere a cualquier red que permita que la información sea transmitida de una localización a otra. Por ejemplo, una red de comunicaciones para la transferencia de información de una computadora a otra incluye cualquier red pública o privada que transfiere la información usando la transmisión vía satélite, eléctrica, óptica, y similares. Dos o más dispositivos que son parte de una red de comunicaciones tal que ellos pueden transmitir directamente o indirectamente la información entre sí, se consideran que están "en la comunicación electrónica" uno con el otro. Una red de ordenadores que contiene computadoras múltiples puede tener una computadora central ("nodo central") que procesa la información a una o más computadoras secundarias que realicen las tareas específicas ("sub-nodos"). Algunas redes comprenden computadoras que están en "diversas localizaciones geográficas" entre sí, significando que las computadoras están situadas en diversas localizaciones físicas (es decir, no están físicamente en la misma computadora, por ejemplo, están situadas en diferentes países, estados, ciudades, habitaciones, etc.). Como se utiliza en la presente, el término "componente de ensayo de detección" se refiere a un componente de un sistema capaz de realizar un ensayo de detección. Los componentes del ensayo de detección incluyen, pero no se limitan a, sondas de hibridación, amortiguadores, y similares. Como se utiliza en la presente, el término " ensayos de detección configurados para la detección del objetivo" se refiere a una colección de componentes de ensayo que son capaces de producir una señal detectable cuando se realiza usando el ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un ensayo de detección que ha demostrado empíricamente detectar un solo polimorfismo particular del nucleótido, se considera un ensayo de detección configurado para la detección del objetivo. Como se utiliza en la presente, la frase "ensayo único de detección" se refiere a un ensayo de detección que tiene una diversa colección de componentes de ensayo de detección en relación a otros ensayos de detección localizados en el mismo panel de detección. Un ensayo único no detecta necesariamente un objetivo diferente (por ejemplo SNP) que otros ensayos en el mismo panel de detección, sino que tiene por lo menos una diferencia en la colección de componentes usados para detectar un objetivo dado (por ejemplo un ensayo único de detección puede emplear secuencias de una sonda, que es más corto o más largo en longitud que otros ensayos en el mismo panel de detección). Como se utiliza en la presente, el término "candidato" se refiere a un ensayo o analito, por ejemplo, un ácido nucleico, sospechado de tener una característica particular o propiedad. Una "secuencia candidato" se refiere a un ácido nucleico sospechado de comprender una secuencia particular, mientras que un "oligonucleótido candidato" se refiere a un oligonucleótido sospechado de tener una característica tal como comprender una secuencia particular, o de tener la capacidad de hibridízar un ácido nucleico objetivo o para realizarse en un ensayo de detección. "Un ensayo de detección candidato" se refiere a un ensayo de detección que se sospecha de ser un ensayo válido de detección. Como se utiliza en la presente, el término "panel de detección" se refiere a un sustrato o dispositivo que contiene por lo menos dos ensayo de detección únicos candidatos configurados para la detección del objetivo. Como se utiliza en la presente, el término "ensayo de detección válido" se refiere a un ensayo de detección que se ha mostrado que predice exactamente una asociación entre la detección de un objetivo y un fenotipo (por ejemplo condición médica). Los ejemplos de los ensayos válidos de detección incluyen, pero no se limitan a, los ensayos de detección que, cuando se detecta un objetivo, predicen exactamente el fenotipo médico de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, o 99.9% del tiempo. Otros ejemplos de los ensayos válidos de detección incluyen, pero no se limitan a, ensayos de detección donde la calidad como y/o son marcados como Reactivos de Analito-Específico (es decir, de acuerdo con lo definido por las regulaciones de FDA) o en el diagnóstico In Vitro (es decir, aprobado por la FDA).

Como se utiliza en la presente, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro para suministrar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, tales sistemas de suministro incluyen los sistemas que permiten el almacenaje, transporte, o suministro de reactivos de reacción (por ejemplo, oligonucleótidos, enzimas, etc. en los envases apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, amortiguadores, instrucciones escritas para realizar el ensayo, etc.) de una localización a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes. Como se utiliza en la presente, el término "kit fragmentado" se refiere a sistemas de suministro que comprenden dos o más envases separados, que cada uno contiene una subporción de los componentes del kit totales. Los envases se pueden suministrar al recipiente previsto junto o por separado. Por ejemplo, un primer envase puede contener una enzima para uso en un ensayo, mientras que un segundo envase contiene oligonucleótidos. El término "kit fragmentado" se desea para que comprenda los kits que contienen los reactivos específicos del Analito (ASR's) regulados bajo la sección 520(e) de la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act, pero no se limitan a la misma. De hecho, cualquier sistema de suministro que comprende dos o más envases separados donde cada uno contiene una subporción de los componentes totales del kit se incluye en el término "kit fragmentado." En contraste, un "kit combinado" se refiere a un sistema de suministro que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un solo envase (por ejemplo, en un solo alojamiento de caja que contiene cada uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye los kits fragmentados y combinados. Como se utiliza en la presente, el término "información" se refiere a cualquier colección de hechos o datos. En referencia a la información almacenada o procesada con un sistema de computadora, incluyendo pero no limitado a, Internéis, el término se refiere a cualquier dato almacenado en cualquier formato (por ejemplo, análogo, digital, óptico, etc.). Como se utiliza en la presente, el término "información relacionada a un sujeto" se refiere a hechos o datos que pertenecen a un sujeto (por ejemplo, un humano, planta, o animal). El término "información genómica" se refiere a la información que pertenece a un genoma incluyendo, pero no limitado a, a las secuencias del ácido nucleico, genes, frecuencias del alelo, niveles de expresión del ARN, expresión de proteína, fenotipos que correlacionan a genotipos, etc. "Información de frecuencia del alelo" se refiere a hechos o datos que pertenecen a frecuencias del alelo, incluyendo, pero no limitado a, identidades de alelo, correlaciones estadísticas entre la presencia un alelo y una característica de un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano), la presencia o ausencia de un alelo en un individuo o población, porcentaje de probabilidad de un alelo que está presente en un individuo que tiene una o más características particulares, etc. Como se utiliza en la presente, el término "información de la validación del ensayo" se refiere a la información genómica e información de la frecuencia del alelo resultante del proceso de los datos resultantes de la prueba (por ejemplo, procesando con la ayuda de una computadora). La información de la validación del ensayo se puede utilizar, por ejemplo, para identificar un ensayo particular de detección candidato como un ensayo de detección válido. Descripción Detallada de la Invención Detección en muestras biológicas Una meta en el diagnóstico molecular ha sido lograr obtener la detección exacta, sensible de analitos en un tiempo tan corto como sea posible con la menos cantidad de trabajo y etapas como sea posible. Una manera en la cual se alcanza esto, es la detección múltiple de analitos en muestras, permitiendo la detección múltiple de casos en un solo recipiente de reacción o solución. Sin embargo, muchos de los métodos de diagnóstico existentes, incluyendo la reacción múltiple, todavía requieren muchas etapas, incluyendo las etapas de preparación de la muestra que agregan tiempo, complejidad, y costo a la conducción de las reacciones. La presente invención, en algunas modalidades, proporciona soluciones a estos problemas proporcionando el ensayo que se puede conducir directamente en muestras biológicas sin purificar o sin tratar (por ejemplo, sangre). La detección directa en muestras biológicas (por ejemplo, sangre, saliva, orina, etc.) ha sido vaga debido a la presencia de factores biológicos numerosos en las muestras naturales que pueden interferir con la función, exactitud, y consistencia de reacciones de diagnóstico. Por ejemplo, muchas tecnologías de detección del ácido nucleico emplean enzimas u otros reactivos que son sensibles a la sal específica y a condiciones de pH o que se someten a proteolisis o inhibición por factores naturales. La presente invención proporciona sistemas y métodos para uso del ensayo INVADER, solos o en combinación con la transcripción inversa y PCR o tecnologías relacionadas, para la detección directa de las secuencias objetivo del ácido nucleico en cualquier muestra deseada (por ejemplo, fluidos corporales sin purificar). Los ejemplos 13 y 14 abajo proporcionan tales ejemplos. Tales métodos se pueden emplear como reacciones individuales o se pueden emplear como reacciones múltiples. Varias modalidades múltiples se describen detalladamente abajo. Así, en algunas modalidades, la presente invención proporciona sistemas, composiciones, kits, y métodos para detectar uno o más ácidos nucleicos objetivo en muestras que comprenden la etapa de exponer la muestra a los reactivos de ensayo de detección bajo condiciones tal que el ácido nucleico objetivo es detectado, si está presente. En modalidades preferidas, el método se realiza en una reacción de una sola etapa. Por ejemplo, una vez que la muestra se exponga a los rea.ctivos, no hay necesidad de agregar reactivos adicionales antes de la etapa de detección. Así, el método se puede realizar en un recipiente de reacción (por ejemplo, un recipiente cerrado de reacción) sin la necesidad de la adición humana o de otra intervención. En modalidades preferidas, el método involucra una reacción de división invasiva con o sin la transcripción inversa y la reacción de la cadena de polimerasa. En otras modalidades preferidas, la reacción de una sola, etapa comprende un oligonucleótido configurado para servir como cebador de transcripción inversa, un cebador de la reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido que forma la estructura de división (por ejemplo, una sonda o un oligo de INVADER en una reacción de división invasiva). Debido a la amplificación de señal, sensibilidad, y capacidad de cuantificar la señal usando una reacción de división invasiva, donde se utiliza la reacción de la cadena de polimerasa, los ciclos limitados necesitan solamente utilizarse (por ejemplo, 20, 15, 12, 10, o menos). Los kits para conducir o asistir a tales métodos pueden comprender uno o más de los reactivo útiles en los métodos. Por ejemplo, en algunas modalidades, los kits comprenden una transcriptasa inversa (por ejemplo, AMV, MMLV, etc.), una polimerasa, una nucleasa 5' (por ejemplo, un endonucleasa FEN-1), y un amortiguador que permita la amplificación detectable del ácido nucleico objetivo en un fluido corporal sin purificar. Reacciones Múltiplex Desde su introducción en 1988 (Chamberlain, y colaboradores, Nucleic Acids Res., 16:11141 (1988)), la PCR múltiplex ha llegado a ser un medio rutinario de amplificar sitios genéticos múltiples en una sola reacción. Este proceso ha encontrado utilidad en un número de investigaciones, así como aplicaciones clínicas. PCR múltiplex se ha descrito para el uso en virología de diagnóstico (Elnifro, y colaboradores, Clinical Microbiology Reviews, 13: 559 (2000)), pruebas de paternidad (Hidding and Schmitt, Forensic Sci. Int., 113: 47 (2000); Bauer y colaboradores, Int. J. Legal Med. 116: 39 (2002)), diagnosis genética del pre-implante (Ouhibi, y colaboradores, Curr Womens Health Rep. 1:138 (2001)), análisis microbiano en muestras ambientales y de alimento (Rudi y colaboradores, lnt J Food Microbiology, 78: 171 (2002)), y medicina veterinaria (Zarlenga and Higgins, Vet Parasitol. 101: 215 (2001)), entre otros. Lo más reciente, la expansión del análisis genético para niveles del genoma totales, particularmente los polimorfismos de un solo nucleótido, o SNPs, ha creado una necesidad de capacidades altamente multiplexadas de la PCR. La asociación amplia-genoma comparativa y los estudios del gen candidato requieren la capacidad al genotipo entre 100,000-500,000 de SNPs por individuo (Kwok, Molecular Medicine Today, 5: 538-5435 (1999); Kwok, Pharmacogenomics, 1:231 (2000); Risch and Merikangas, Science, 273: 1516 (1996)). Por otra parte, SNPs en regiones de codificación o reguladoras alteran la función del gen de maneras importantes (Cargill y colaboradores Nature Genetics, 22: 231 (1999); Halushka y colaboradores, Nature Genetics, 22: 239 (1999)), haciendo a estos SNPs herramientas de diagnóstico útiles en la medicina personalizada (Hagmann, Science, 285: 21 (1999); Cargill y colaboradores, Nature Genetics, 22: 231 (1999); Halushka y colaboradores, Nature Genetics, 22: 239 (1999)). Asimismo, la validación de la asociación médica de un grupo de SNPs identificado previamente por su importancia clínica potencial como parte de un panel de diagnóstico, significará pruebas a millares de individuos para miles de marcadores a la vez. A pesar de su amplio atractivo y utilidad, varios factores complican la amplificación de PCR múltipiex. El principal entre éstos es el fenómeno PCR o desviación de la amplificación, en donde ciertos sitios se amplifican a un mayor grado que otros. Dos clases de desviación de amplificación se han descrito. Una, referida como la derivación de PCR, se atribuye a la variación estocástica en las etapas tales como el templado del cebador durante las primeras fases de la reacción (Polz and Cavanaugh, Applied and Environmental Microbiology, 64: 3724 (1998)), no es reproductiva, y puede ser más frecuente cuando las cantidades muy pequeñas de moléculas objetivo se están amplificando (Walsh y colaboradores, PCR Methods and Applications, 1:241 (1992)). La otra, referida como selección de PCR, pertenece a la amplificación preferencial de algunos sitios basados en las características de los cebadores, longitud del amplicón, contenido de G-C, y otras características del genoma (Polz, supra). Otro factor que afecta el grado al cual las reacciones de PCR pueden ser multiplexadas, es la tendencia inherente de las reacciones de PCR para lograr obtener una fase de meseta. La fase de meseta se considera en los últimos ciclos de PCR y refleja la observación que la generación del amplicón se mueve desde el exponencial a la acumulación pseudo-lineal y después para eventualmente el aumento. Este efecto parece que es debido a las interacciones no específicas entre la polimerasa del ADN y ios productos de hebras dobles por sí mismos. La relación molar del producto a la enzima en la fase de meseta es típicamente constante para varias polimerasas del ADN, incluso cuando diversas cantidades de enzima se incluyen en la reacción, y es aproximadamente 30: 1 producto: enzima. Este efecto limita así la cantidad total de producto de hebra doble que se puede generar en una reacción de PCR tal que el número de diferentes sitios amplificados debe ser equilibrado contra la cantidad total de cada am plicón deseado para el análisis subsecuente, por ejemplo por electrofóresis del gel, expansión del cebador, etc. Debido a que estas y otras consideraciones, aunque la PCR multiplexada incluye 50 sitios, se han descrito (Lindblad-Toh y colaboradores, Nature Genet. 4: 381 (2000)) , el multiplexado se limita típicamente a menos de diez productos distintos. Sin embargo, dada la necesidad de analizar tanto como 1 00, 000 a 450, 000 SNPs de una sola muestra del ADN genómico, existe una necesidad ciara de medios de ampliar las capacidades de multiplexación de las reacciones de PCR. La presente invención proporciona métodos para la multiplexación sustancial de las reacciones de PCR mediante, por ejemplo, com binando el ensayo I NVADER con la am plificación de PCR múltiplex. El ensayo INVADER proporciona una etapa de detección y amplificación de señal que permite que una gran cantidad de objetivos sean detectados en una reacción múltiple. De acuerdo con lo deseado, de cientos a miles de objetivos se pueden detectar en una reacción múltiple. El genotipo directo por el ensayo INVADER típicamente usa de 5 a 100 ng de ADN genómico humano por SNP, dependiendo de la plataforma de detección. Para un número pequeño de ensayos, las reacciones se pueden realizar directamente con ADN genómico sin la pre-amplificación del objetivo, sin embargo, con más de 100,000 ensayos INVADER realizados e incluso un número más grande esperado para los estudios de la asociación amplia-genoma, la cantidad de ADN de la muestra puede llegar a ser un factor limitante.

Debido a que el ensayo INVADER proporciona la amplificación de señal de 106 a 107 veces, PCR multiplexada en combinación con el ensayo INVADER utilizaría solamente la amplificación objetivo limitada con respecto a una PCR típica. Por consiguiente, el nivel bajo de la amplificación del objetivo alivia la interferencia entre las reacciones individuales en la mezcla y reduce la inhibición de PCR por su acumulación de sus productos, proporcionando así una multiplexación más extensa. Además, se contempla que los niveles bajos de la amplificación disminuyen una probabilidad de la contaminación cruzada del objetivo y disminuyen el número de mutaciones de la PCR-inducida. La amplificación desigual de diferentes sitios presenta uno de los desafíos más grandes del desarrollo de PCR multiplexado. Diferencias en factores de amplificación entre dos sitios puede dar lugar a una situación donde la señal generada por una reacción INVADER con un sitio de amplicación lenta está debajo del límite de detección del ensayo, mientras que la señal de un sitio de amplificación rápida está más allá del nivel de saturación del ensayo. Este problema se puede tratar de varias maneras. En algunas modalidades, las reacciones de INVADER que se pueden leer en diferentes puntos de tiempo, por ejemplo, en tiempo real, prolongan así de forma significativa la gama dinámica de detección.

En otras modalidades, PCR múltiplex se puede realizar bajo condiciones que permitan diferentes sitios para lograr niveles más similares de amplificación. Por ejemplo, concentraciones de cebadores pueden ser limitadas, de tal modo permitiendo que cada sitio alcance un nivel más uniforme de amplificación. En aún otras modalidades, concentraciones de cebadores de PCR se pueden ajusfar para equilibrar los factores de amplificación de diferentes sitios. La presente invención proporciona el diseño y las características de PCR altamente múltiple incluyendo de cientos a miles de productos en una sola reacción. Por ejemplo, la pre-amplificación de! objetivo proporcionada por la PCR de 100-ples reduce la cantidad del ADN genómico humano requerido para el genotipo de SNP basado en INVADER de menos de 0.1 ng por ensayo. Los detalles de la optimización de PCR altamente múltiple y un programa de Computadora para el diseño del cebador, se describen abajo. Además de proporcionar los métodos para la PCR altamente múltiple, la presente invención proporciona además métodos de conducir reacciones de transcripción inversa y de amplificación de señal y del objetivo en un recipiente de una sola reacción sin manipulaciones subsecuentes o adiciones del reactivo más allá de la disposición inicial de la reacción. Tales reacciones combinadas son adecuadas para el análisis cuantitativo de .limitar cantidades del objetivo en tiempos de reacción muy cortos. La discusión siguiente proporciona una descripción de ciertas modalidades ilustrativas preferidas de la presente invención y no se desea limitar el alcance de la presente invención. I. Diseño del Cebador de la PCR múltiplex El ensayo INVADER se puede utilizar para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) con tan poco como 10-100 ng de ADN genómico sin la necesidad de la pre-amplificación del objetivo. Sin embargo, con más de 50,000 de ensayos INVADER ejecutados y el potencial por los estudios de asociación del genoma entero que involucran la participación de cientos a miles de SNPs, la cantidad de ADN de la muestra llega a ser un factor limitante para el análisis a gran escala. Debido a la sensibilidad del ensayo INVADER en el ADN genómico humano (hgADN) sin la amplificación del objetivo, la PCR múltiplex acoplada con el ensayo INVADER requiere solamente la amplificación del objetivo limitada (103-104) con respecto a las reacciones típicas de PCR múltiplex que requieren la amplificación extensa (10B-1012) para los métodos de detección de gel convencionales. El nivel bajo de la amplificación del objetivo usado para la detección por INVADER™ proporciona una multiplexación más extensa evitando la inhibición de la amplificación que resulta comúnmente de la acumulación del objetivo. La presente invención proporciona métodos y criterios de selección que permiten que grupos de cebadores para que la PCR múltiplex sea generada (por ejemplo, que se puede acoplar con un ensayo de detección, tal como el ensayo INVADER). En modalidades preferidas, la presente invención proporciona un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como el cabador de transcripción inversa, un cebador de la reacción de la cadena de polimerasa y como el oligo INVADER para la reacción del ensayo de división invasivo. En algunas modalidades, las aplicaciones del software de la presente invención proporcionan una selección del cebador de PCR múltiplex automatizada, permitiendo así una PCR altamente múltiple con los cebadores diseñó para la misma. Usando al INVADER Medically Associated Panel (MAP) mientras que una plataforma correspondiente para la detección de SNP, de acuerdo con lo mostrado en el ejemplo 2, los métodos, software, y criterios de selección de la presente invención permiten un genotipo exacto de 94 de los 101 amplicones posibles (~ 93%) de una sola reacción de PCR. La reacción original de PCR utilizó solamente 10 ng de hgADN como patrón, correspondiendo menos de 150 pg de hgADN por ensayo INVADER. El ensayo INVADER permite la detección simultánea de dos alelos distintos en la misma reacción usando un formato isotérmico, de una sola adición. La discriminación del alelo ocurre por la división de la "estructura específica" de la sonda, liberando una aleta 5' que corresponde a un polimorfismo dado. En la segunda reacción, la aleta 5' liberada media la generación de señal por la división del módulo apropiado de FRET. La creación de uno de los pares de cebador (un cebador delantero e inverso) para grupos de cebador 101 de las secuencias disponibles para el análisis en el INVADER Medically Associated Panel que usa una modalidad de la aplicación del software de la presente invención, implica el fichero de entrada de la muestra de una sola entrada (por ejemplo, la información de la secuencia objetivo para una sola secuencia objetivo que contiene un SNP que se procesa en el método y software de la presente invención). La información de la secuencia objetivo incluye el identificador de nombre corto, Third Wave Technologies's SNP#, y la secuencia con la localización de SNP indicada entre paréntesis. El archivo de salida de la muestra de la misma entrada (por ejemplo, que muestra la secuencia objetivo después de ser procesada por los sistemas y métodos y software de la presente invención, incluye la secuencia de la región de huella (sitio de SNP flanqueado por mayúsculas, mostrando a región donde las sondas de ensayo INVADER hibridizan esta secuencia objetivo para detectar el SNP en la secuencia objetivo), las secuencias del cebador delanteras e inversas (en negritas), y su Tms correspondiente. En algunas modalidades, la selección de cebadores para hacer un grupo cebador capaz de una PCR múltiplex se realiza de manera automatizada (por ejemplo por una aplicación del software). La selección del cebador automatizada para la PCR múltiplex se puede lograr empleando un programa de software diseñado de acuerdo con lo mostrado por el diagrama de flujo en la figura 8. PCR múltiplex requiere comúnmente la optimización extensa para evitar la amplificación desviada de amplicones selectos y la amplificación de productos falsos resultando de la formación de cebador-dímeros. Para evitar estos problemas, la presente invención proporciona métodos y la aplicación del software que proporcionan criterios de selección para generar un grupo cebador configurado para una PCR múltiplex, y el uso subsecuente en un ensayo de detección (por ejemplo ensayos de detección INVADER). En algunas modalidades, los métodos y aplicaciones del software de la presente invención comienzan con las secuencias definidas por el usuario y las localizaciones correspondientes de SNP. En ciertas modalidades, la aplicación de métodos y/o software determina una región de huella dentro de la secuencia objetivo (el amplicón mínimo requerido para la detección por INVADER) para cada secuencia. La región de huella incluye la región donde las sondas de ensayo hibridizan, así como cualquier base adicional definida por el usuario que se extiende por lo tanto hacia afuera (por ejemplo 5 bases adicionales incluidas en cada lado de donde las sondas de ensayo hibridizan). Después, los cebadores se diseñan hacia afuera de la región de huella y se evalúan contra varios criterios, incluyendo el potencial para la formación del cebador-dímero con cebadores previamente diseñados en el sistema actual de multiplexación. Este proceso se puede continuar a través de iteraciones múltiples del mismo sistema de secuencias hasta que los cebadores contra todas las secuencias en el sistema, actual de multiplexación, pueden diseñarse. Una vez que se diseñe un grupo cebador, la PCR múltiplex se puede realizar, por ejemplo, bajo condiciones estándares usando solamente 10 ng de hgADN como patrón. Después de 10 minutos a 95°C, Taq (2.5 unidades) se puede agregar a una reacción de 50ul y la PCR realizada por 50 ciclos. La reacción de PCR se puede diluir y cargar directamente sobre una placa INVADER MAP (3ul/pozo). Un 3ul adicional de 15mM de MgCI2 se puede agregar a cada reacción en la placa de INVADER MAP y cubrir con 6ul de aceite mineral: La placa entera se puede después calentar a 95°C por 5 min. e incubar a 63°C por 40 minutos. La fluorescencia FAM y RED se puede entonces medir en un lector de placa fluorescente Cytofluor 4000 y los valores "Fold Over Zero" (FOZ) calculados para cada amplicón. Los resultados de cada SNP pueden ser de color codificado en una tabla como "paso" (verde), "llamado erróneamente" (color rosa), o "no-llamado" (blanco) (véase, ejemplo 2 abajo). En algunas modalidades, el número de reacciones de PCR es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 reacciones. En algunas modalidades, el número de reacciones de PCR es de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 reacciones. En otras modalidades, el número de reacciones de PCR es de aproximadamente 50 a aproximadamente 100. En las modalidades adicionales, el número de reacciones de PCR es de alrededor 100 a 1,000. En aún otras modalidades, el número de reacciones de PCR es mayor de 1 ,000. La presente invención también proporciona métodos para optimizar reacciones de PCR múltiplex (por ejemplo una vez que se genere un grupo cebador, la concentración de cada par cebador o cebador puede ser optimizada). Por ejemplo, una vez que un grupo cebador se haya generado y se haya utilizado en una PCR múltiplex en concentraciones molares iguales, los cebadores se pueden evaluar por separado tal que la concentración óptima del cebador se es determinada tal que el grupo cebador múltiple se realiza mejor. Las reacciones de PCR múltiplex se están reconociendo en las industrias científicas, investigación, clínicas y de biotecnología como medios potencialmente efectivos en tiempo y menos costosos para obtener la información del ácido nucleico comparados a las reacciones de PCR monoplex estándares. En vez de realizar solamente una sola reacción de amplificación por recipiente de reacción (por ejemplo tubo o pozo de una placa multi-pozo), numerosas reacciones de amplificación se realizan en un recipiente de una sola reacción.

El costo por objetivo es menor teóricamente eliminando el tiempo del técnico en el equipo de ensayo y análisis de datos, y por los ahorros sustanciales en el reactivo (especialmente el costo de la enzima). Otra ventaja del proceso múltiple es que menos muestra del objetivo es requerido. En estudios de la asociación del genoma completo, la participación de cientos de miles de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), la cantidad del objetivo o muestra de prueba se limita para el análisis a gran escala, así que el concepto de realizar una sola reacción, usando una alícuota de muestra para obtener, por ejemplo, 100 resultados, contra usar 100 alícuotas de muestra para obtener el grupo de datos, es una opción atractiva. Para diseñar cebadores para una reacción acertada de PCR múltiplex, el problema de la interacción aberrante entre los cebadores debe tratarse. La formación de dímeros-cebadores, incluso si sólo algunas bases en longitud, pueden inhibir ambos cebadores de la hibridación correcta a la secuencia objetivo. Además, si los dímeros se forman en o cerca de los extremos 3' de los cebadores, ninguna amplificación o niveles muy bajos de la amplificación ocurrirá, puesto que el extremo 3' se requiere para el caso de oscurecimiento. Claramente, los cebadores más utilizados por la reacción múltiple, las interacciones más aberrantes del cebador son posibles. Los métodos, sistemas y aplicaciones de la actual ayuda previenen a los dímeros-cebadores en grupos grandes de cebadores, haciendo el grupo adecuado para la PCR altamente múltiple. En particular, en modalidades preferidas, la presente invención proporciona un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como el cabador de transcripción inversa, un cebador de reacción de la cadena de polimerasa y como el oligo INVADER para la reacción del ensayo de división invasivo, disminuyendo de tal modo de manera significativa el número de cebadores/oligonucleótidos usado por la reacción múltiple, de tal modo limitando las anomalías antecedentes (por ejemplo, dímeros-cebadores). Al diseñar pares de cebadores para el sitio numeroso (por ejemplo 100 sitios en una reacción de PCR múltiplex), el orden en el cual se diseñan los pares de cebadores puede influenciar el número total de pares compatibles de cebadores para una reacción. Por ejemplo, si un primer grupo de cebadores se diseña para una primera región objetivo que sucede que es una región objetivo rica en A/T, este cabador será rico en A/T. Si la segunda región objetivo elegida también sucede que es una región objetivo rica de A/T, es más probable que los cebadores diseñados para estos dos sistemas sean incompatibles debido a las interacciones aberrantes, tales como dímeros-cebadores. Sin embargo, si la segunda región objetivo elegida no es rica en A/T, es mucho más probable que un grupo cebador pueda ser diseñado tal que no interactúe con el primer grupo rico en A/T. Para cualquier grupo dado de secuencias objetivo de entrada, la presente invención selecciona al azar el orden en el cual se diseñan los grupos de cebadores (véase, figura 8). Además, en algunas modalidades, la presente invención reordena el grupo de secuencias objetivo de entrada en una pluralidad de arreglos diversoss, al azar para maximizar el número de grupos cebadores compatibles para cualquier reacción múltiple dada (véase, figura 8). La presente invención proporciona criterios para el diseño del cebador que minimice las interacciones de 3' mientras se maximice el número de pares de cebador compatibles para un grupo dado de objetivos de reacción en un diseño múltiple. Para los cebadores descritos como 5'-N[x]-N[x-1]-...-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', N[1] es una A o C (en modalidades alternativas, N[1] es un G o T). N[2]-N[1] de cada uno de los cebadores delantero e inverso diseñados no debe ser complementario a N[2]-N[1] de ningún otro oligonucleótido. En ciertas modalidades, N[3]-N[2]-N[1] no debe ser complementario a N[3]-N[2]-N[1] de ningún otro oligonucleótido. En modalidades preferidas, si estos criterios no se cumplen en un N[1] dado, la base siguiente en la dirección de 5' para el cabador delantero o la base siguiente en la dirección de 3' para el cabador inverso se puede evaluar como un sitio de N[1]. Este proceso se repite, en combinación con la randomización del objetivo, hasta que todos los criterios se cumplan para todos, o en una gran mayoría de, las secuencias objetivo (por ejemplo 95% de las secuencias objetivo puede tener pares cebadores hechos para el grupo cebador que satisface estos criterios). Otro desafío que se superará en un diseño de cebador múltiple es el equilibrio entre la secuencia real, requerida del nucleótido, la longitud de la secuencia, y las restricciones de temperatura de fusiónn del oligonucleótido (Tm). De manera importante, puesto que los cebadores en un grupo cebador múltiple en una reacción deben funcionar bajo mismas condiciones de reacción del amortiguador, sales y temperatura, necesitan por lo tanto tener Tm's sustancialmente similares, sin importar GC o la riqueza en AT de la región de interés. La presente invención permite un diseño de cebador que cumple con los requisitos de Tm mínima y Tm máxima y los requisitos de longitud mínimos y máximos. Por ejemplo, en la fórmula para cada cebador 5'-N[x]-N[x-1]-...-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3\ x se selecciona tal que el cabador tiene una temperatura de fusión predeterminada (por ejemplo, las bases se incluyen en el cabador hasta que el cabador tiene una temperatura de fusión calculada de aproximadamente 50 grados centígrados). Frecuentemente, los productos de una reacción de PCR se utilizan como el material objetivo para otros medios de detección del ácido nucleico, tal como los ensayos de detección tipo hibridación, o los ensayo de reacción INVADER, por ejemplo. La consideración se debe dar a la localización de la colocación del cebador para permitir que una reacción secundaria ocurra con éxito, y nuevamente, las interacciones aberrantes entre los cebadores de amplificación y los oligonucleótidos de reacción secundaria se deben reducir al mínimo para los resultados y datos correctos. Los criterios de selección pueden emplearse tal que los cebadores diseñados para un grupo cebador múltiple no reaccionen (por ejemplo por la hibridación con, o reacciones de activación) con los componentes del oligonucleótido de un ensayo de detección. Por ejemplo, para evitar que los cebadores reaccionen con el oligonucleótido de FRET de un ensayo INVADER bi-ples, ciertos criterios de homología se emplean. En particular, si cada uno de los cebadores en el grupo se define como 5'-N[x]-N[x-1]-...-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', entonces N[4]-N[3]-N[2]-N[1]- 3' se selecciona tal que es menos 90% homólogo con los oligonucleótidos de FRET o INVADER. En otras modalidades, N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3' se selecciona para cada cebador tal que es menos de 80% homólogo con los oligonucleótidos de FRET o INVADER. En ciertas modalidades, N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3' se selecciona para cada cebador tal que es menos de 70% homólogo con los oligonucleótidos de FRET o INVADER. Mientras que se empleen los criterios de la presente invención para desarrollar un grupo cebador, algunos pares cebadores pueden no cumplir con todos los criterios indicados (éstos se pueden rechazar como errores). Por ejemplo, en un grupo de 100 objetivos, 30 se diseñan y cumplen con todos los criterios mencionados, sin embargo, el grupo 31 fallido. En el método de la presente invención, el grupo 31 se puede señalar como fallido, y el método podría continuar a través de la lista de 100 objetivos, señalando otra vez los grupos que no cumplen los criterios (véase la figura 8). Una vez que los 100 objetivos hayan tenido una oportunidad en el diseño del cebador, el método observará el número de grupos fallidos, re-ordenar los 100 objetivos en un nuevo orden aleatorio y repetirá el proceso del diseño (véase, figura 8). Después de un número configurable de ejecuciones, el grupo con los pares cebadores más pasados (el último número de grupos fallidos) se elige para la reacción de PCR múltiplex (véase figura 8). La figura 8 muestra un diagrama de flujo con el flujo básico de ciertas modalidades de los métodos y aplicación del software de la presente invención. En modalidades preferidas, los procesos detallados en la figura 8 se incorporan en una aplicación del software para facilidad de uso (aunque, los métodos se pueden también realizar manualmente usando, por ejemplo, la figura 8 como guía). Las secuencias objetivo y/o pares cebadores se incorporan en el sistema mostrado en la figura 8. El primer grupo de cuadros muestra cómo las secuencias objetivo se agregan a la lista de secuencias que tienen una huella determinada (véase "B" en la figura 8), mientras que otras secuencias se pasan inmediatamente en el estanque del grupo cebador (por ejemplo PDPass, las secuencias que se han procesado y mostrado previamente para trabajar juntas sin la formación de dímeros-cebadores o tener reactividad a las secuencias de FRET), así como las entradas de DimerTest (por ejemplo par o cebadores que un usuario desea utilizar, pero que no se han probado todavía para la reactividad de FRET o cebador-dímero). Es decir, el grupo inicial de cuadros que conduce al "extremo de la entrada" clasifica las secuencias para que puedan procesarse más adelante correctamente. Comenzando en "A" en la figura 8, el estanque del cebador es despejado básicamente o "vaciado" para comenzar una ejecución reciente. Las secuencias objetivo entonces se envían a "B" para ser procesadas, y los pares de DimerTest se envían a "C" para su proceso. Las secuencias objetivo se envían a "B", donde un usuario o aplicación del software determina la región de huella para la secuencia objetivo (por ejemplo donde las sondas de ensayo hibridizarán para detectar la mutación (por ejemplo, SNP) en la secuencia objetivo). Es importante diseñar esta región (que el usuario puede ampliar definiendo que las bases adicionales más allá de la región de hibridación estén agregadas) tal que los cebadores se diseñan comprendan completamente esta región. En la figura 8, se utiliza la aplicación del software INVADER CREATOR para diseñar de aunque el oligonucleótido INVADER y las sondas descendientes que se hibridizarán con la región objetivo (cualquier tipo de programa del sistema se podría utilizar para crear cualquier tipo sondas que un usuario esté interesado en diseñar las sondas para, y así determinar la región de huella en la secuencia objetivo). Así, la región de huella central entonces es definida por la localización de estas dos sondas de ensayo en el objetivo. Después, el sistema empieza del borde de 5' de la huella y viaja en la dirección de 5' hasta que se alcanza la primera base, o hasta que la primera A ó C (o G ó T) se alcance. Esto se establece como el punto de partida inicial para definir la secuencia del cebador delantero (es decir, éste sirve como el N[1]inicial). De este sitio inicial N[1], la secuencia del cebador para el cabador delantero es igual que las bases encontradas en la región objetivo. Por ejemplo, si el tamaño determinado del cebador se fija como 12 bases, el sistema comienza con las bases seleccionadas como N[1] y entonces agrega las 11 bases siguientes encontradas en las secuencias objetivo. Este cebador 12-mer entonces se prueba a una temperatura de fusión (por ejemplo usando INVADER CREATOR), y las bases adicionales se agregan de la secuencia objetivo hasta que la secuencia tenga una temperatura de fusión que sea señalada por el usuario como las temperaturas de fusión mínimas y máximas predeterminadas (por ejemplo de aproximadamente 50 grados centígrados, y no más de 55 grados centígrados). Por ejemplo, el grupo emplea la fórmula 5'-N[x]-N[x-1]-...-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]~3\ y x es inicialmente 12. Entonces el sistema ajusta x a un número más alto (por ejemplo secuencias más largas) hasta que la temperatura de fusión preestablecida "fee encuentra. En ciertas modalidades, un tamaño máximo de cebador se emplea como un parámetro predeterminado para servir como un límite superior en la longitud de los cebadores diseñados. En algunas modalidades, el tamaño máximo del cebador es de aproximadamente 30 bases (por ejemplo 29 bases, 30 bases, o 31 bases). En otras modalidades, los ajustes predeterminados (por ejemplo tamaño mínimo y máximo del cebador, y Tm mínima y máxima) pueden modificarse usando herramientas de manipulación de la base de datos estándares. La siguiente casilla en la figura 8, se utiliza para determinar si el cebador que se ha diseñado hasta ahora causa la reactividad del cebador-dímero y/o FRET (por ejemplo ya con las otras secuencias en el estanque). El criterio usado para esta determinación se explicó anteriormente. Si el cebador pasa esta etapa, el cebador delantero se agrega al estanque de cebador. Sin embargo, si el cebador delantero no cumple este criterio, de acuerdo con lo mostrado en la figura 8, el punto de inicio (N[1]) mueve un nucleótido en la dirección 5' (o a la siguiente A ó C, o a la siguiente G ó T). El sistema primero verifica para asegurarse que el cambio deje suficiente espació en la secuencia objetivo para elaborar con éxito un cebador. Sí, el sistema vuelve al ciclo y verifica la temperatura de fusión de este nuevo cebador. Sin embargo, si ninguna secuencia se puede diseñar, entonces la secuencia objetivo se indica como un error (por ejemplo indicando que ningún cebador delantero se puede hacer para este objetivo). Este mismo proceso entonces se repite para diseñar el cebador inverso, de acuerdo con lo mostrado en la figura 8. Si un cebador inverso se hace con éxito, entonces el par o cebadores se colocan en el estanque de cebador, y el sistema vuelve a "B" (si hay más secuencias objetivo a procesar), o va sobre "C" para probar los pares DimerTest. Iniciando una "C" en la figura 8 muestra cómo los pares de cebadores que se incorporan como cebadores (DimerTest) son procesados por el sistema. Si no hay pares de DimerTest, según lo mostrado en la figura 8, el sistema va sobre "D". Sin embargo, si hay pares de DimerTest, éstos se prueban para determinar la reactividad del cebador-dímero y/o FRET de acuerdo con lo descrito anteriormente. Si el par de DimerTest no cumple estos criterios se indican como errores. Si el par de DimerTest cumple el criterio, se agregan al estanque del grupo cebadores, y entonces el sistema vuelve a "C" si hay más pares de DimerTest que evaluar, o va sobre "D" si no hay más pares de DimerTest que evaluar. Comenzando en "D" en la figura 8, se evalúa el estanque de cebadores que se ha creado. La primera etapa en esta sección es para examinar el número del error (fallas) generado por este funcionamiento aleatorizado particular de secuencias. Si no hubo errores, este conjunto es el mejor conjunto que puede haber para un usuario. Si hay más de cero errores, el sistema compara este funcionamiento con cualquier otro funcionamiento anterior para observar que funcionamiento dio lugar a pocos errores. Si el funcionamiento actual tiene pocos errores, se designa como el mejor conjunto actual. En este punto, el sistema puede volver a "A" para iniciar el funcionamiento con otro sistema conjunto aleatorizado de las mismas secuencias, o el número máximo preestablecido de funcionamientos (por ejemplo 5 funcionamientos) se pudo haber logrado en este funcionamiento (por ejemplo éste fue el quinto funcionamiento, y el número máximo de funcionamientos fue establecido como 5). Si se ha alcanzado el máximo, entonces el mejor conjunto es producido como el mejor conjunto. Este mejor grupo cebadores entonces se puede utilizar para generarse como el conjunto físico de oligonucleótidos tal que una reacción múltiple de PCR se pueda llevar a cabo. Otro desafío que se superará con reacciones de PCR múltiplex, es las concentraciones desiguales del amplicón que dan lugar a una reacción múltiple estándar. Los diferentes lugares objetivo para la amplificación pueden cada uno comportarse diferentemente en la reacción de amplificación, produciendo concentraciones ampliamente diferentes de cada uno de los diferentes productos del amplicón. La presente invención proporciona métodos, sistemas, aplicaciones de software, sistemas computacionales, y un medio de almacenamiento de datos de computadora que se pueden utilizar para ajusfar las concentraciones de cebador en relación a una primera lectura del ensayo de detección (por ejemplo, lectura del ensayo INVADER), y después con las concentraciones equilibradas del cebador llegan a ser casi concentraciones sustancialmente iguales de diferentes amplicones. Las concentraciones para varios pares de cebadores se pueden determinar experimentalmente. En algunas modalidades, hay un primer funcionamiento conducido con todos los cebadores en concentraciones equimolares. Entonces se conducen las lecturas de tiempo. En base a las lecturas de tiempo, se determinan los factores de amplificación relativos para cada amplicón. Después en base a una ecuación de corrección unificada, una estimación de que tanta concentración de cebador debe obtenerse para tener las señales casi dentro del mismo punto de tiempo. Estos ensayos de detección pueden estar en un arreglo de diferentes tamaños (placas de 384 pozos). Se aprecia que combinando la invención con ensayos de detección y arreglos del ensayo de detección, proporciona eficacias de procesamiento sustanciales. Utilizando una mezcla balanceada de cebadores o pares de cebadores creada con la invención, una lectura de un solo punto se puede realizar a modo que un usuario promedio pueda obtener grandes eficacias al conducir pruebas que requieren alta sensibilidad y especificidad a través de un arreglo de diferentes objetivos. Teniendo optimizadas las concentraciones de par de cebadores en un solo recipiente de reacción, permite que el usuario conduzca la amplificación para una pluralidad o multiplicidad de objetivos de amplificación en un solo recipiente de reacción y en un una sola etapa. La producción del proceso de una sola etapa entonces se utiliza para obtener con éxito los datos de resultado de la prueba para, por ejemplo, varios cientos de ensayos. Por ejemplo, cada uno de los pozos en una placa de 384 pozos, puede tener un diferente ensayo de detección en la misma. Los resultados de la reacción de PCR múltiplex de una sola etapa han amplificado 384 diferentes objetivos de ADN genómico, y proporcionan los 384 resultados de la prueba para cada placa. Donde cada uno pozo tiene una pluralidad de ensayos incluso se pueden obtener mayores eficacias. Por lo tanto, la presente invención proporciona el uso de la concentración de cada grupo cebador en PCR altamente m últiple como un parámetro para lograr una amplificación imparcial de cada producto de PCR. Cualq uier PCR incluye las etapas de templado de cebador y de extensión de cebador. Bajo las condiciones estándares de PCR, la concentración alta de cebadores en el orden de 1 uM asegura la cinética rápida del templado de cebadores mientras que el tiempo óptimo de la etapa de extensión de cebador depende del tamaño del producto amplificado y puede ser mucho más largo q ue la etapa de templado. Reduciendo la concentración de cebador, la cinética de cebador de templado puede convertirse en u na etapa de limitación de velocidad y el factor de amplificación de PCR debe depender fuertemente de la concentración de cebador, constante de velocidad de asociación de los cebadores , y del tiempo de templado. La unión del cebador P con el objetivo T se puede describir por el modelo siguiente: P+T- ^PT (1) donde Ka es la constante de velocidad de asociación del templado de cebador. Se asume que el templado ocurre a temperaturas por debajo de la fusión del cebador y se puede ignorar la reacción inversa.

La solución para esta cinética bajo las condiciones de un exceso de cebador es bien conocida: [PTJ = T^(\-e r^kñcat) • (2) donde [PT] es la concentración de las moléculas objetivo asociadas con el cebador, T0 es la concentración objetivo inicial, c es la concentración inicial de cebador, y t es el tiempo de templado del cebador. Si se asume que cada molécula objetivo asociada con el cebador está duplicad para producir el producto de PCR de tamaño completo, el factor de amplificación de objetivo en un solo ciclo de PCR es Z=?±E3. = 2~e-Il»ci (3) El factor total de amplificación de PCR después de n ciclos se da por F¡*ZB**(2-e-k'cíjn (4) Siguiente de la ecuación 4, bajo condiciones donde la cinética de templado de cebador es la etapa de limitación de velocidad de PCR, el factor de amplificación debe depender fuertemente de la concentración de cebador. Así, la amplificación de lugares predispuestos, si es causada por las constantes individuales de velocidad de asociación, las etapas de extensión de cebador o cualquier otro factor, se puede corregir ajusfando la concentración de cebador para cada cebador establecido en la PCR múltiplex. Las concentraciones de cebador ajustadas también se pueden utilizar para corregir el funcionamiento predispuesto del ensayo INVADER usado para el análisis de lugares pre-amplificados de PCR. Utilizando este principio básico, la presente invención ha demostrado una relación linear entre la eficacia de amplificación y la concentración de cebador y ha utilizado esta ecuación para equilibrar las concentraciones de cebador de diferentes amplicones, dando por resultado la amplificación igual de diez amplicones diferentes en el ejemplo 1. Esta técnica se puede utilizar en cualquier grupo de tamaños de pares de cebadores múltiplex. II. Diseño del Ensayo de Detección La siguiente sección describe los ensayos de detección que se pueden utilizar con la presente invención. Por ejemplo, muchos ensayos diferentes se pueden utilizar para determinar el espacio ocupado en la secuencia de ácido nucleico objetivo, y después utilizarse como el funcionamiento del ensayo de detección en el producto de la PCR múltiplex (o los ensayos de detección puede funcionar simultáneamente con la reacción de PCR múltiplex). Hay una variedad amplia de tecnologías de detección disponibles para determinar la secuencia de un ácido nucleico objetivo en una o más ubicaciones. Por ejemplo, hay numerosas tecnologías disponibles para detectar la presencia o ausencia de SNPs. Muchas de estas técnicas requieren el uso de un oligonucleótido para la hibridación del objetivo. Dependiendo del ensayo usado, el oligonucleótido después se divide, alarga, liga, desasocia, o altera de otra manera, en donde su comportamiento en el ensayo se monitorea como un medio para caracterizar la secuencia del ácido nucleico objetivo. Un número de estas tecnologías se describen detalladamente, en la Sección IV, posteriormente. La presente invención proporciona sistemas y métodos para el diseño de oligonucleótidos para el uso en los ensayos de detección. En particular, la presente invención proporciona sistemas y métodos para el diseño de oligonucleótidos que hibridazan con éxito a regiones apropiadas de ácidos nucleicos objetivo (por ejemplo, regiones de ácidos nucleicos objetivo que no contienen la estructura secundaria) bajo las condiciones de reacción deseadas (por ejemplo, temperatura, condiciones del amortiguador, etc.) para el ensayo de detección. Los sistemas y métodos también permiten para el diseño de diferentes oligonucleótidos múltiples (por ejemplo, oligonucleótidos que hibridizan diferentes porciones de un ácido nucleico objetivo o que hibridizan dos o más ácidos nucleicos objetivo diferentes) que toda la función en el ensayo de detección las mismas o sustancialmente las misma condiciones de reacción. Estos sistemas y métodos también se pueden utilizar para diseñar las muestras de control que trabajan bajo las condiciones experimentales de reacción.

Mientras que los sistemas y métodos de la presente invención no se limitan a ningún ensayo de detección particular, la siguiente descripción ¡lustra la invención cuando se utiliza en combinación con el ensayo INVADER (Third Wave Technologies, Madison Wl; ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,846,717, 5,985,557, 5,994,069, y 6,001,567, Publicaciones PCT WO 97/27214 y WO 98/42873, y de Arruda y col., Expert. Rev. Mol. Diagn. 2(5), 487-496 (2002), que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad) para detectar un SNP. El ensayo INVADER proporciona los niveles de facilidad de uso y sensibilidad que, cuando se utiliza en combinación con los sistemas y métodos de la presente invención, encuentra uso en los paneles de detección, ASRs y diagnósticos clínicos. El experto en la técnica apreciará que las características específicas y generales de este ejemplo ilustrativo sean generalmente aplicables a otros ensayos de detección. A. Ensayo INVADER El ensayo INVADER proporciona medios para formar una estructura de división de ácido nucleico que es dependiente de la presencia de un ácido nucleico objetivo y para dividir la estructura de división de ácido nucleico a modo de liberar los productos de división distintivos. La actividad de nucleasa 5', por ejemplo, se utiliza para dividir la estructura de división dependiente del objetivo y los productos de la división resultantes son indicativos de la presencia de secuencias específicas de ácido n ucleico objetivo en la muestra. La división invasiva puede ocurrir cuando dos hebras de ácido nucleico , o oligonucleótidos , hibrídizan un hebra de ácido nu cleico objetivo tal q ue forman una estructura de división I nvasiva traslapada , de acuerdo con lo descrito posteriormente. A través de la i nteracción de un agente de división (por ejemplo, una nucleasa 5') y del oligonucleótido corriente arriba, el agente de división se puede hacer para dividir el oligonucleótido descendente en un sitio interno de una manera tal que se prod uce un fragmento distintivo.

En algu nas modalidades, el ensayo I NVAD ER proporciona ensayos de detección en los cu ales el ácido n ucleico objetivo se reutiliza o recicla durante rondas múltiples de hibridación con las sondas del oligonucleótido y división de las sondas sin la necesidad de utilizar un ciclo de temperatura (es decir, para la desnaturalización periódica de hebras de ácido n ucleico objetivo) o síntesis de ácido n ucleico (es decir, para el desplazamiento basado en la polimerización de hebras de ácido nucleico objetivo o de sonda) . Cuando u na reacción de d ivisión fu nciona bajo las condiciones en las cuales las sondas se remplazan contin uamente en la hebra objetivo (por ejemplo a través del desplazamiento sonda-sonda o a través de un equilibrio entre la asociación y desasociación sonda/objetivo , o a través de una combinación que comprende estos mecanismos, (Reynaldo , y col, J . Mol . Biol. 97: 51 1 -520

[2000]) , las sondas mú ltiples pueden hibridizar al mismo objetivo, permitiendo las divisiones múltiples, y la generación de productos de la división múltiples. B. Diseño del Oli onucleótido para el Ensayo INVADER En algunas modalidades donde un oligonucleótido se diseña para el uso en el ensayo INVADER para detectar un SNP, las secuencias de interés se incorporan en el programa INVADERCREATOR (Third Wave Technologies, Madison, Wl). De acuerdo con lo descrito anteriormente, las secuencias se pueden ingresar para el análisis de cualquier número de fuentes, directamente en la computadora que contienen el programa INVADERCREATOR, o vía una computadora remota ligada a través de una red de comunicaciones (por ejemplo, una red LAN, de Intranet o Internet). El programa diseña las sondas para la hebra de sentido y anti-sentido. La selección de la hebra se basa generalmente en la facilidad de la síntesis, minimización de la formación de la estructura secundaria, y de la capacidad de fabricación. En algunas modalidades, el usuario elige la hebra para que las secuencias sean diseñadas. En otras modalidades, el software selecciona automáticamente la hebra. Incorporando los parámetros termodinámicos para la ciclación óptima de sonda y la generación de señal (Allawi y SantaLucia, Biochemistry, 36:10581

[1997]), las sondas del oiigonucleótido se pueden diseñar para operar a una temperatura de ensayo pre-seleccionada (por ejemplo, 63°C). De acuerdo con estos criterios, se selecciona un grupo final de sondas (por ejemplo, sondas primarias para 2 alelos y un oligonucleótido INVADER). En algunas modalidades, el sistema INVADERCREATOR es un programa basado en la red con acceso seguro del sitio que contiene un vínculo a BLAST (disponible en el National Centrer for Biotechnology Infromation, Natlional Library of Medicine, sitio de red National Institutes of Health) y que se pueden vincular a ARNstructure (Mathews y col, RNA 5:1458

[1999]), un programa de software que incorpora Mfold (Zuker, Science, 244:48

[1989]). ARNstructure prueba los diseños del oligonucleótido propuestos generados por INVADERCREATOR para la formación potencial compleja uni- y bi-molecular. INVADERCREATOR cumple con la conectividad a base de datos abierta (ODBC) y usa la base de datos Oracle para la exportación/integración. El sistema INVADERCREATOR fue configurado con Oracle para trabajar bien con los sistemas UNIX, puesto que la mayoría de los centros del genoma se basan en UNIX. En algunas modalidades, el análisis INVADERCREATOR se proporciona en un servidor separado (por ejemplo, un servidor Sun), así puede controlar el análisis de tratamientos por lotes grandes. Por ejemplo, un cliente puede someter hasta 2,000 secuencias de SNP en un correo electrónico. El servidor pasa el lote de secuencias al software INVADERCREATOR, y, cuando se inicia, el programa diseña los grupos de oligonucleótidos del ensayo de detección. En algunas modalidades, los diseños del grupo de sondas se regresan al usuario dentro de un periodo de 24 horas de recibir las secuencias. Cada reacción INVADER incluye por lo menos dos oligonucleótidos sin marcar específicos de la secuencia objetivo para la reacción primaria: un oligonucleótido INVADER ascendente y un oligonucleótido de sonda descendente. El oligonucleótido INVADER se diseña generalmente para unirse establemente a la temperatura de reacción, mientras que la sonda se diseña para asociarse y desasociarse libremente de la hebra objetivo, con la división que ocurre solamente cuando una sonda sin cortar hibridiza adyacente a un oligonucleótido INVADER traslapado. En algunas modalidades, la sonda incluye una ala o "brazo" 5' que no es complementario al objetivo, y esta ala se libera de la sonda cuando ocurre la división. En algunas modalidades, el ala liberada participa como un oligonucleótido INVADER en una reacción secundaria. La siguiente discusión proporciona un ejemplo de cómo se puede configurar una interfase de usuario para un programa INVADERCREATOR. El usuario abre una pantalla de trabajo, por ejemplo, haciendo clic en un icono en una exhibición del escritorio de una computadora (por ejemplo, escritorio de Windows). El usuario ingresa la información relacionada a la secuencia objetivo para la cual un ensayo debe diseñarse. En algunas modalidades, el usuario ingresa una secuencia objetivo. En otras modalidades, el usuario ingresa un código o número que causa la recuperación de una secuencia de una base de datos. En todavía otras modalidades, la información adicional se puede proporcionar, tal como el nombre del usuario, un número de identificación asociado a una secuencia objetivo, y/o un número de orden. En modalidades preferidas, el usuario indica (por ejemplo vía una casilla de verificación o menú abierto) que el ácido nucleico objetivo es ADN o ARN. En otras modalidades preferidas, el usuario indica la especie de la cual se deriva el ácido nucleico. En modalidades particularmente preferidas, el usuario indica si el diseño está para la detección monople (es decir, un secuencia o alelo objetivo por reacción) o múltiple (es decir, las secuencias o alelos objetivo múltiples por reacción). Cuando las opciones e ingresos requeridos están completos, el usuario inicia el proceso de análisis. En una modalidad, el usuario hace clic en el botón "6o Design It" para continuar. En algunas modalidades, el software valida los ingresos de campos antes de proceder. En algunas modalidades, el software verifica que cualquier campo requerido esté completado con el tipo de información apropiado. En otras modalidades, el software verifica que la secuencia de entrada cumpla los requisitos seleccionados (por ejemplo, longitud mínima o máxima, contenido de ADN o ARN). Si se encuentra que los ingresos en cualquiera de los campos no son válidos, puede aparecer un mensaje o casilla de diálogo de error. En las modalidades preferidas, el mensaje de error indica qué campo está incompleto y/o incorrecto. Una vez que se verifica un ingreso de secuencia, el software procede con el diseño del ensayo. En algunas modalidades, la información suministrada en los campos de ingreso de orden especifica qué tipo de diseño será creado. En las modalidades preferidas, la secuencia objetivo y la casilla de verificación múltiple especifican qué tipo de diseño se creará. Las opciones de diseño incluyen pero no se limitan a, ensayo de SNP, ensayo de SNP múltiple (por ejemplo, en donde los grupos de sondas para alelos diferentes se combinaran en una sola reacción), al ensayo de SNP multiplexado (por ejemplo, en donde una secuencia de entrada tiene sitios múltiples de variación para los cuales los grupos de sondas se diseñaran), y los ensayo Múltiple Probé Arm. En algunas modalidades, el software INVADERCREATOR se inicia vía un proceso Web Order Entry (WebOE) (es decir, a través de una interfase del navegador Intra/lnternet) y estos parámetros se transfieren del WebOE vía las etiquetas <param> de la miniaplicación, en lugar de incorporarse a través de menús o casillas de verificación. En el caso de Múltiple SNP Designs, el usuario elige dos o más diseños para trabajar con ellos. En algunas modalidades, esta selección abre una nueva vista de la pantalla (por ejemplo, una vista de Múltiple SNP Design Selection). En algunas modalidades, el software crea los diseños para cada lugar en la secuencia objetivo, registrando y presentando cada uno de ellos al usuario en esta vista de la pantalla. El usuario entonces puede elegir cualquiera de los dos diseños para trabajar con ellos. En algunas modalidades, el usuario elige un primer y segundo diseños (por ejemplo, vía un menú o botones) y hace clic en el botón "Go Design It" para continuar. Para seleccionar una secuencia de sonda, que se realizara óptimamente a una temperatura de reacción pre-seleccionada, la temperatura de fusión (Tm) de SNP que se detectará se calcula usando el vecino más cercano y los parámetros publicados para la formación del dúplex de ADN (Allawi y SantaLucia, Biochemistry, 36:10581

[1997]). En las modalidades en donde la hebra objetivo es ARN, se pueden utilizar los parámetros apropiados para la formación del heterodúplex de ARN/ADN. Debido a que las concentraciones de sal del ensayo son frecuentemente diferentes a las condiciones de la solución en las cuales se obtuvieron los parámetros de vecino más cercano (1M de NaCI y ningún metal bivalente), y debido a que la presencia y la concentración de la enzima influencia la temperatura óptima'de reacción, un ajuste se debe hacer a la Tm calculada para determinar la temperatura óptima a la cual se realiza una reacción. Una forma de compensar estos factores es variar el valor proporcionado para la concentración de sal dentro de los cálculos de la temperatura de fusión. Este ajuste es llamado 'corrección de sal'. Según lo utilizado en la presente, el término "corrección de sal" se refiere a una variación hecha en el valor proporcionado para una concentración de sal con el fin de reflejar el efecto en un cálculo de Tm para un dúplex de ácido nucleico de un parámetro o condición no salina que afecta al dúplex. La variación de los valores proporcionados para las concentraciones de hebra también afectará el resultado de estos cálculos. Usando un valor de 0.5 M de NaCI (SantaLucia, Proc Nati Acad Sci E.E.U.U., 95:1460

[1998]) y las concentraciones de hebra de aproximadamente 1 mM de sonda y 1 mM de objetivo, el algoritmo para utilizarse para calcular la temperatura de fusión de la sóndaobjetivo se ha adaptado para el uso en la predicción de la temperatura óptima de la reacción del ensayo INVADER. Para un grupo de 30 sondas, la desviación promedio entre las temperaturas óptimas del ensayo calculadas por este método y las determinadas experimentalmente es de aproximadamente 1.5°C. La longitud de la sonda descendente para un SNP dado es definida por la temperatura seleccionada para ejecutar la reacción (por ejemplo, 63°C). Iniciando desde la posición del nucle?tido variable en el ADN objetivo (la base objetivo que se parea al nucleótido 5' de sonda del sitio de división previsto), y agregando en el extremo 3', un procedimiento iterativo se utiliza, mediante el cual la longitud de la región de unión al objetivo de la sonda se aumenta en un par base al mismo tiempo que una temperatura óptima de reacción calculada (Tm más la corrección de sal para compensar el efecto de la enzima) se logra igualar a la temperatura de reacción deseada. El brazo no-complementario de la -sonda es seleccionado preferiblemente para permitir que la reacción secundaria se cicle a la misma temperatura de reacción. Se visualiza el oligonucleótido de sonda entero usando usando los programas tales como Mfold (Zuker, Science, 244: 48

[1989]) u Oligo 5.0 (Rychlik y Rhoads, Nucleics Acids Res, 17: 8543

[1989]) para la formación posible de complejos de dímero o estructuras secundarias que podrían interferir con la reacción. Los mismos principios también se siguen para el diseño del oligonucleótido INVADER. Brevemente, iniciando desde la posición N en el ADN objetivo, el extremo 3' del oligonucleótido INVADER se diseña para que tenga un nucleótido no complementario para cualquier alelo que se sospeche que esté contenido en la muestra que se probará. La desigualdad no afecta negativamente la división (Lyamichev y col., Nature Biotechnology, 17: 292

[1999]), y pueden mejorar la ciclación de la sonda, probablemente minimizando los efectos de estabilización coaxiales entre las dos sondas. Los residuos adicionales complementarios al ADN objetivo que inician desde el residuo N-1 entonces se agregan en la dirección 5' de hasta que la estabilidad del híbrido de objetivo-oligonucleótido INVADER exceda la de la sonda (y por lo tanto la temperatura de reacción del ensayo prevista), generalmente por 15-20°C. Es un aspecto del diseño del ensayo que todas las secuencias de la sonda se pueden seleccionar para permitir que las reacciones primarias y secundarias ocurran a la misma temperatura óptima, de modo que las etapas de reacción puedan ejecutarse simultáneamente. En una modalidad alternativa, las sondas se pueden diseñar para operar a diferentes temperaturas óptimas, de modo que las etapas de reacción no estén simultáneamente a su temperatura óptima. En algunas modalidades, el software proporciona al usuario una oportunidad de cambiar varios aspectos del diseño que incluyen pero no se limitan a: temperatura óptima concentraciones de la sonda, objetivo y oligonucleótido INVADER; grupos de bloqueo; brazos de sonda; tintes, grupos de restricción y otras aducciones; bases individuales de las sondas y objetivos (por ejemplo, agregando o eliminando bases del extremo de los objetivos y/o sondas, o cambiando las bases internas en los oligonucleótidos INVADER y/o de sonda y/o objetivo). En algunas modalidades, los cambios son realizados por la selección de un menú. En otras modalidades, los cambios se ingresan en casillas de texto o diálogo. En las modalidades preferidas, esta opción abre una pantalla nueva (por ejemplo, una vista Designer Worksheet). En algunas modalidades, el software proporciona un sistema de registro para indicar la calidad (por ejemplo, la probabilidad del funcionamiento) de los diseños del ensayo. En una modalidad, el sistema de registro incluye un registro de inicio de puntos (por ejemplo, 100 puntos) en donde el registro de inicio es indicativo de un diseño ideal, y en donde se les asignan valores de penalización a las características de diseño que se conocen o sospechan que tengan un efecto negativo sobre el funcionamiento del ensayo. Los valores de penalización pueden variar dependiendo de los parámetros del ensayo diferentes de las secuencias, incluyendo pero sin limitarse a, el tipo de ensayo para el cual se desea el diseño (por ejemplo, monople, múltiple) y la temperatura a la cual la reacción del ensayo se realizará. El siguiente ejemplo proporciona un criterio de registro ilustrativo para el uso con algunas modalidades del ensayo INVADER basado en una inteligencia definida por la experimentación. Los ejemplos de las características del diseño que pueden incurrir en penalizaciones del registro incluyen pero no se limitan a los siguientes [los valores de penalización se indican en los paréntesis, el primer número es para los ensayos con una temperatura inferior (por ejemplo, 62-64°C), el segundo es para ensayos con una temperatura superior (por ejemplo, 65-66°C)]: 1. [100:100] extremo 3' del oligonucleótido de INVADER se parece al brazo de sonda: SECUENCIA DEL BRAZO: PENALIDAD CONCEDIDA SI EL INVADER TERMINA EN: Brazo 1: CGCGCCGAGG 5'...GAGGX o 5'...GAGGXX Brazo 2: ATGACGTGGCAGAC 5'...CAGACX o 5'...CAGACXX Brazo 3: ACGGACGCGGAG 5'...GGAGX o 5'...GGAGXX Brazo 4: TCCGCGCGTCC 5'...GTCCX o 5'...GTCCXX 2. [70:70] una sonda tiene el alargamiento 5-base (es decir, 5 de la misma base en una fila) contiene el polimorfismo; 3. [60:60] una sonda tiene el alargamiento 5-base adyacente al polimorfismo; 4. [50:50] una sonda tiene una base del alargamiento 5-base del polimorfismo; 5. [40:40] una sonda tiene dos bases del alargamiento 5-base del polimorfismo; 6. [50:50] el alargamiento de la sonda 5-base es de una penalidad Gs - adicional; 7. [100:100] una sonda tiene el alargamiento 6-base dondequiera; 8. [90:90] dos o tres repeticiones de la secuencia base de por lo menos cuatro veces; 9. [100:100] una base degenerada ocurre en una sonda; 10. [60:90] la región de hibridación de sonda es corta (13 bases o menos para los diseños 65-67°C; 12 bases o menos para los diseños 62-64°C); 11. [40:90] la región de hibridación de sonda es larga (29 bases o más para los diseños 65-67°C, 28 bases o más para los diseños 62-64°C); 12. [5:5] la longitud de la región de hibridación de sonda - por base de penalizado adicional; 13. [80:80] el diseño Ins/Del con discriminación pobre en las primeras 3 bases después del brazo de sonda; 14. [100:100] la Tm del oligonucleótido INVADER calculada dentro de 7.5°C de la Tm objetivo de sonda (diseños 65-67°C con el oligonucleótido INVADER menor de < 70.5°C, diseños 62-64°C con el oligonucleótido INVADER < 69.5°C; 15. [20:20] las Tms de sondas calculadas difieren por más de 2.0°C; 16. [100:100] una sonda tiene la Tm calculada 2°C menor de su Tm objetivo; 17. [10:10] objetivo de una hebra de 8 bases más largas que la otra hebra; 18. [30:30] el oligonucleótido INVADER tiene alargamiento de 6-base dondequiera - penalizado inicial; 19. [70:70] el alargamiento de 6-base del oligonucleótido INVADER es de Gs - penalizado adicional 20. [15:15] la región de hibridación de sonda es 14, 15 ó 24-28 bases de largo (65-67°C) o 13, 14 ó 26, 27 bases de largo (62-64°C); 21. [15:15] una sonda tiene un alargamiento de 4-base de Gs que contiene el polimorfismo. En las modalidades particularmente preferidas, las temperaturas para cada uno de los oligonucleótidos en los diseños se volvieron a computarizar y los puntajes se volvieron a computarizar como se hicieron los cambios. En algunas modalidades, las descripciones del puntaje pueden verse presionando un botón de "descripciones". En algunas modalidades, se proporciona una opción de búsqueda BLAST. En modalidades preferidas, una búsqueda BLAST se hace presionando un botón "Diseño BLAST". En algunas modalidades, esta acción produce una caja de diálogo que describe el proceso BLAST. En modalidades preferidas, los resultados de búsqueda BLAST se exhiben como diseño destallado en una Designer Worksheet. En algunas modalidades, un usuario acepta un diseño presionando un botón "Acepto". En otras modalidades, el programa aprueba un diseño sin intervención del usuario. En las modalidades preferidas, el programa envía el diseño aprobado a una siguiente etapa de proceso (por ejemplo, en la producción; en un archivo o base de datos). En algunas modalidades, el programa proporciona una vista en pantalla (por ejemplo, una Output Page), permitiendo la revisión de los diseños finales creados y permitiendo que las notas se unan al diseño. En las modalidades preferidas, el usuario puede regresar a la Designer Worksheet (por ejemplo, presionando un botón "Go Back") o puede guardar el diseño (por ejemplo, presionando el botón "Save It") y continuar (por ejemplo, someter los oligonucleótidos diseñados para producción). En algunas modalidades, el programa proporciona una opción para crear una vista en pantalla de un diseño optimizado para imprimir (por ejemplo, una vista de texto-solamente) u otra exportación (por ejemplo, una vista de Salida). En las modalidades preferidas, la vista de Output proporciona una descripción del diseño particularmente adecuado para impresión, o para exportar en otra aplicación (por ejemplo, copiando y pegando en otra aplicación). En las modalidades particularmente preferidas, la vista de Output se abre en una ventana separada. La presente invención no se limita al uso del software INVADERCREATOR. De hecho, una variedad de programas del software se contemplan y está disponible comercialmente, incluyendo, pero sin limitarse el GCG Wisconsin Package (Genetics computer Group, Madison, Wl) y vector NT1 (Mbrmax, Rockville, Maryland). Otros ensayo de detección pueden utilizarse en la presente invención. 1. Ensayo de Secuenciación Directa En algunas modalidades de la presente invención, las secuencias variables se detectan utilizando una técnica de secuenciación directa. En estos ensayos, las muestras de ADN primero se aislan de un sujeto utilizando cualquier método adecuado. En algunas modalidades, la región de interés se clona en un vector adecuado y amplifica mediante crecimiento en una célula hospedadora (por ejemplo, una bacteria). En otras modalidades, el ADN en la región de interés se amplifica utilizando PCR. Después de la amplificación, el ADN en la región de interés (por ejemplo, la región que contiene el SNP o mutación de interés) es secuenciado utilizando cualquier método adecuado, incluyendo pero sin limitarse a secuenciación manual utilizando nucleótidos marcadores radiactivos, o secuenciación automatizada. Los resultados de secuenciación se exhiben utilizando cualquier método adecuado. Se examina la secuencia y la presencia o ausencia de un SNP dado o mutación se determina. 2. Ensayo de PCR En algunas modalidades de la presente invención, las secuencias variables se detectan utilizando un ensayo basado en PCR. En algunas modalidades, el ensayo de PCR comprenden el uso de cebadores de oligonucleótido que hibridaza solamente la variante o alelo tipo silvestre (por ejemplo, a la región de polimorfismo o mutación). Ambos grupos de cebadores se utilizan para amplificar una muestra de ADN. Si solamente los cebadores mutantes dan lugar a un producto de PCR, entonces el paciente tiene el alelo muíante. Si solamente los cebadores tipo silvestre dan lugar a un producto de PCR, entonces el pacieníe fiene el alelo íipo silvestre. 3. Ensayos de Polimorfismo de longitud en fragmentos En algunas modalidades de la presente invención, las secuencias variables se detectan utilizando un ensayo de Polimorfismo de longitud en fragmentos. En un ensayo de Polimorfismo de longitud en fragmentos, un paírón de unión de ADN único basado en la división del ADN en una serie de posiciones se generó utilizando una enzima (por ejemplo, una enzima de restricción o una enzima CLEAVASE I [Third Wave Technologies, Madison, Wl]). Los fragmentos del ADN de una muesíra que coníiene un SNP o una mutación tendrán un patrón de unión diferente que el del íipo silvestre. a. Ensayo de RFLP En algunas modalidades de la presente invención, las secuencias variables se detecían uíilizando un ensayo de polimorfismo de longitud en fragmentos de restricción (RFLP). La región de interés primero se aisla utilizando PCR. Los productos de PCR entonces se dividen con enzimas de restricción conocidas para dar un fragmenío de longitud único para un polimorfismo dado. Los productos de PCR digeridos restricción-enzima se separaron generalmente por electrofóresis de gel y pueden visualizarse íiñendo con bromuro de etidio. La longitud de los fragmentos se compara con los marcadores y fragmeníos de peso molecular generados a paríir de los controles tipo silvestre y mutaníe. b. Ensayo de CFLP En otras modalidades, las secuencias variables se detectan utilizando un ensayo de polimorfismo de longitud en fragmentos CLEAVASE (CFLP; CFLP; Third Wave Technologies, Madison, Wl; Ver por ejemplo, Patenfes Noríeamericanas Nos. 5,843,654; 5,843,669; 5,719,208; y 5,888,780; cada una de las cuales se incorpora por referencia en la preseníe). Este ensayo se basa en la observación que cuando las hebras sencillas de ADN se doblan sobre sí mismas, asumen las estrucíuras de orden mayor que son alíameníe individuales a la secuencia exacía de la molécula del ADN. Estas estrucíuras secundarias involucran regiones parcialmeníe duplicadas de ADN tal que las regiones en hebras sencillas se juxtaponen con las horquillas de ADN en hebras dobles. La enzima de CLEAVASE I, es una nucleasa de estructura-específica, termoestable que reconoce y divide las uniones entre éstas regiones de una sola hebra y hebra doble.

La región de interés primero se aisla, por ejemplo, utilizando PCR. En las modalidades preferidas, se marcaron una o ambas hebras. Entonces, las hebras de ADN se separaron medianíe caleníamienío. Después, las reacciones se enfriaron para permifir a la estructura secundaria de intrahebra formarse. Los productos de PCR entonces se tratan con la enzima de CLEAVASE I para generar una serie de fragmentos que son únicos para un SNP o muíación dada. Los producios de PCR írafados de la enzima de CLEAVASE son separados y detectados (por ejemplo, mediante electroforesis en gel desnaturalizaníe) y visualizados (por ejemplo, medianíe auíoradiografía, formación de imágenes medianíe fluorescencia o manchado). La longiíud de los fragmeníos se compara con los marcadores de peso molecular y fragmeníos generados de coníroles íipo silvesíre y muíaníe. 4. Ensayos de Hibridación En las modalidades preferidas de la preseníe invención, las secuencias variables se deíectan en un ensayo de hibridación. En un ensayo de hibridación, la presencia de ausencia de un SNP o mutación dada se determina basada en la capacidad del ADN de muestra para hibridizar una molécula de ADN complementaria (por ejemplo, una sonda del oligonucleótido). Una variedad de ensayos de hibridación que utiliza una variedad de tecnologías para hibridación y detección está disponible. Se proporciona una descripción de una selección de ensayo a continuación. a. Detección Directa de Hibridación En algunas modalidades, la hibridación de una sonda para la secuencia de interés (por ejemplo, un SNP o mutación) es detectada directamente visualizando una sonda de enlace (por ejemplo, un ensayo de Northern o Southern; Ver por ejemplo, Ausabel y colaboradores (eds.), Current Proíocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY

[1991]). En esfos ensayos, el ADN genómico (Southern) o ARN (Northern) se aisla de un sujeto. El ADN o ARN entonces se divide con una serie de enzimas de restricción que infrecuentemente se dividen en el genoma y no se acerca a cualquiera de los marcadores que se ensayan. El ADN o ARN entonces es separado (por ejemplo, en un gel de agarosa) y transferido a una membrana. Una sonda o sondas marcadas específicas (por ejemplo, incorporación de un radionucleóíido) para el SNP o muíación que se deíecían, se permiíen para poner en contacto la membrana bajo una condición o condiciones de severidad baja, media, o alia. Se elimina la sonda de desunión y la presencia de unión es deíecíada visualizando la sonda marcada. b. Detección de Hibridación Utilizando ensayos de "Chip de ADN" En algunas modalidades de la preseníe invención, las secuencias variables se detectan el usar de un ensayo de hibridación del chip de ADN. En este ensayo, una serie de sondas del oligonucleótido se añaden a un soporte sólido. Las sondas del oligonucleótido se diseñan para ser únicas para un SNP o mutación dada. La muesíra de ADN de interés se pone en contacto con el "chip" de ADN y se detecta la hibridación. En algunas modalidades, el ensayo del chip de ADN es un GeneChip (Affymetrix, Sania Clara, CA; Ver por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,045,996; 5,925,525; y 5,858,659; cada una de las cuales en la presente se incorpora por referencia). La tecnología de GeneChip utiliza arreglos miniaturizados, de alta densidad de sondas del oligonucleótido agregados a un "chip". Los arreglos de sonda son elaborados mediante el proceso de síntesis química de luz-dirigida de Affymetrix, que combina la síntesis química de fase sólida con las técnicas de fabricación fotolitográficas utilizadas en la industria del semiconductor. Utilizando una serie de máscaras fotolitográficas para definir los sitios de exposición del chip, seguida por las etapas químicos de síntesis específicas, el proceso construye arreglos de alta densidad de oligonucleótidos, con cada sonda en una posición predefinida en el arreglo. Los arreglos de sonda múlíiples se sintetizan simultáneamente en una oblea de cristal grande. Las obleas entonces se cortan en cuadritos, y los arreglos individuales de sonda se empaquetan en casetes plásticos moldeados por inyección, que los protegen contra el ambiente y sirven como cámaras para la hibridación. El ácido nucleico a analizarse es aislado, amplificado por PCR, y marcado con un grupo reportero fluoresceníe. El ADN marcado eníonces se incubó con el arreglo uíilizando una esíación fluídica. El arreglo entonces se inserta en el escáner, donde los patrones de hibridación se detecían. Los datos de hibridación se recolectan como la luz emitida desde los grupos reportero fluorescentes ya incorporados en el objetivo, que se ligan al arreglo de sonda. Las sondas que perfectamente igualan las señales fuertes del producto generalmente objetivo que tienen los desajustes. Puesto que la secuencia y posición de cada sonda en el arreglo se conocen, mediante complementariedad, la identidad del ácido nucleico objetivo aplicado al arreglo de sonda puede ser determinada. En otras modalidades, un microchip de ADN que contiene sondas electrónicamente capturadas (Nanogen, San Diego, CA) se uíiliza (ver por ejemplo, Paíeníes Norteamericanas Nos. 6,017,696; 6,068,818; y 6,051,380; cada una de las cuales se incorpora por referencia). A través del uso de la microelectrónica, tecnología de Nanogen permiíe el movimiento activo y concentración de moléculas cargadas a y desde sitios de prueba designados en su microchip semiconductor. Las sondas de captura del ADN únicas para un SNP o mutación dado se colocan electrónicameníe en, o a "dirige" a, sitios específicos en el microchip. Puesto que el ADN tiene una carga negativa fuerte, puede moverse electrónicameníe a un área de carga positiva. Primero, un sitio de prueba o una fila de sitios de prueba en el microchip se activa electrónicamente con una carga positiva. Después, una solución que contiene las sondas de ADN se iníroduce en el microchip. Las sondas negativameníe cargadas se mueven rápidamente a los siíios positivameníe cargados, donde se concentran y químicamente se ligan a un sitio en el microchip. El microchip entonces se lava y otra solución de sondas de ADN distinías se agrega hasía que el arreglo de las sondas de ADN específicamente ligado, se completa. Una muestra de prueba entonces se analiza para la presencia de moléculas de ADN objetivo determinándose cuáles de las sondas de captura de ADN se hibridizan, con ADN complementario en la muestra de prueba (por ejemplo, un gene amplificado por PCR de interés). También se utiliza una carga electrónica para mover y concentrar las moléculas objetivo en uno o más sitios de prueba en el microchip. La concentración electrónica del ADN de muestra en cada sitio de prueba promueve la hibridación rápida del ADN de muestra con sondas de captura complementarias (la hibridación puede ocurrir en minutos). Para eliminar cualquier ADN desligado o no específicamente ligado de cada sitio, la polaridad o carga del sitio se invierte a negativo, de tal modo forzando cualquier ADN desligado o no específicamente ligado nuevamente en solución lejos de las sondas de captura. Se utiliza un escáner de fluorescencia basado en láser para detectar la unión. En aún otras modalidades, se utiliza una tecnología de arreglo basada en la segregación de fluidos en una superficie plana (chip) por las diferencias en la tensión superficial (ProtoGene, Palo Alio, CA) (ver por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,001,311; 5,985,551; y 5,474,796; cada una de las cuales es incorpora en la presente por referencia). La tecnología del protogen se basa en el hecho de que los fluidos pueden segregarse en una superficie plana por las diferencias en la íensión superficial que se han impartido por los revestimientos químicos. Una vez que se segregaron, las sondas del oligonucleótido se sintetizan directamenfe en el chip medianíe la impresión por inyección de tinta de los reactivos. El arreglo con sus sitios de la reacción definido por la tensión superficial se monta en una etapa de traducción X/Y bajo un conjunto de cuatro boquillas piezoeléctricas, una para cada una de las cuatro bases de ADN estándares. La eíapa de íraducción se mueve a lo largo de cada una de las filas del arreglo y el reactivo apropiado se libera en cada uno del sitio de reacción. Por ejemplo, la amidita A se libera solamente en los sitios donde la amidita A se acopla durante la etapa de síntesis y así sucesivamente. Los reactivos y lavados comunes se distribuyen sumergiéndose en agua la superficie completa y después eliminándolos mediante girado. Las sondas de ADN únicas para el SNP o mutación de interés se aseguran al chip utilizando la íecnología de Proíogen. El chip eníonces se pone en coníacio con los genes de PCR-amplificado de interés. Después de la hibridación, se elimina el desligado de ADN y se detecía la hibridación uíilizando cualquier méíodo adecuado (por ejemplo, medianíe de-enfriamiento rápido de fluorescencia de un grupo fluorescente incorporado). En aún otras modalidades, se uíiliza un "arreglo de pelotilla" para la defección de polimorfismos (lllumina, San Diego, CA; Ver por ejemplo, Publicaciones PCT WO 99/67641 y WO 00/39587, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia), lllumina utiliza una tecnología BEAD ARRAY que combine un conjunío de fibras ópticas y pelotillas que se ensamblan en un arreglo. Cada conjunto de fibras ópticas contiene millares a millones de fibras individuales dependiendo del diámeíro del conjunto. Las pelotillas se revistieron con un oligonucleóíido específico para la defección la un SNP o muíación dada. Los loíes de pelotillas se combinan para formar una acumulación específica del arreglo. Para realizar un ensayo, el BEAD ARRAY se pone en confacío con una muesfra del sujeío preparada (por ejemplo, ADN). La hibridación se deíecía utilizando cualquier método adecuado. c. Detección Enzimática de Hibridación En algunas modalidades de la presente invención, la hibridación es detecíada por división enzimáíica de las esírucíuras específicas (ensayo INVADER, Third Wave Technologies; Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,846,717, 6,090,543; 6,001,567; 5,985,557; y 5,994,069; cada una de las cuales es incorpora en la presente por referencia). El ensayo INVADER detecía el ADN específico y secuencias de ARN utilizando enzimas de estrucfura-específica para dividir un complejo formado mediante la hibridación de sobreponer las sondas de oligonucleótido. La temperaíura elevada y un exceso de una de las sondas permiten sondas múltiples para dividirse para cada secuencia objetivo presente sin ciclación de temperatura. Estas sondas divididas entonces dirigen la división de una segunda sonda marcada. El oligonucleótido de sonda secundario puede ser el extremo 5' marcado con un tiníe fluorescente que es retardado por un segundo tiníe u otra porción retardadora. Duraníe la división, el producto de tiníe de marcado de-retraso puede detectarse utilizando un lector de placa de fluorescencia estándar, o un instrumento configurado para recolectar datos de fluorescencia durante el curso de la reacción (es decir, un detecíor de fluorescencia "en fiempo real", íal como un ABI 7700 Sequence Deíecíion System, Applied Biosystems, Fosfer City, CA). El ensayo INVADER detecía mufaciones específicas y SNPs en el ADN genómico no amplificado. En una modalidad del ensayo INVADER utilizado para deíecíar SNPs en el ADN genómico, dos oligonucleóíidos (un primario específico de sonda para un SNP/mutación o secuencia tipo silvestre, y un oligonucleótido INVADER) se hibridizan en tándem al ADN genómico para formar una estrucíura sobrepuesta. Una enzima nucleasa de estrucíura-específica que reconoce esta estructura sobrepuesta y divide la sonda primaria. En una reacción secundaria, la sonda primaria dividida se combina con una sonda secundaria de fluorescencia-marcada para crear otra estructura sobrepuesta que sea dividida por la enzima. Las reacciones inicial y secundaria pueden llevarse a cabo conjuntamente en el mismo recipiente. La división de la sonda secundaria es detecíada uíilizando un deíector de fluorescencia, como se describe antes. La señal muestra de prueba puede ser comparada conociéndose los controles positivos y negativos.

En algunas modalidades, la hibridación de una sonda de enlace se detecta utilizando un ensayo TaqMan (PE Biosystems, Fosíer Ciíy; Ver por ejemplo, Paíeníes Norfeamericanas Nos. 5,962,233 y 5,538,848, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia). El ensayo se realiza durante una reacción de PCR. El ensayo TaqMan utiliza la actividad de la exonucleasa 5'-3' de las ADN polimerasas tal como la ADN polimerasa AMPL1TAQ. Una sonda, específica para un alelo o mutación dada, se incluye en la reacción de PCR. La sonda consiste de un oligonucleótido con un tiníe del reportero 5' (es decir, un íiníe fluoresceníe) y un íinfe retardador 3'. Durante el PCR, si la sonda se liga a su objetivo, la actividad nucleolítica 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ divide la prueba eníre el reporíero y el íinte retardador. La separación del tinte reportero del íiníe reíardador da lugar a un incremenío de fluorescencia. La señal acumulada con cada ciclo de PCR puede monitorearse con un fluorímetro. En aún oirás modalidades, los polimorfismos se deíecian uíilizando el ensayo de exíensión del cebador de SNP-IT (Orchid Biosciences, Princeton, NJ; Ver por ejemplo, Paíentes Noríeamericanas Nos. 5,952,174 y 5,919,626, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia). En este ensayo, los SNPs son identificados utilizando un cebador de ADN especialmente sintetizada y una polimerasa de ADN para selectivamente extender la cadena de ADN por una base en la localización de SNP sospechada. El ADN en la región de interés se amplifica y desnaturaliza. Las reacciones de polimerasa entonces se llevan a cabo utilizando sistemas miniaturizados llamados microfluídicos. La detección es realizada agregando un marcado al nucleótido sospechoso de estar en la localización del SNP o mutación. La incorporación del marcado en el ADN puede detectarse por cualquier método adecuado (por ejemplo, si el nucleótido contiene un marcado de biotina, la detección es vía un anticuerpo fluorescentemente marcado específico para la biotina). III. Entradas de la Secuencia e Interfaces Utilizadas Las secuencias pueden introducirse para el análisis de cualquier número de fuentes. En muchas modalidades, la información de la secuencia se iníroduce en una computadora. La computadora no necesita ser el mismo sistema de computadora que realice el ensayo in silico. En algunas modalidades preferidas, las secuencias objetivo candidato pueden introducirse en una computadora enlazada a una red de comunicaciones (por ejemplo, una red de área local, Internet o Intraneí). En íales modalidades, los usuarios en cualquier parfe del mundo con acceso a una red de comunicaciones pueden ingresar a las secuencias candidaío en su propio sitio. En algunas modalidades, se proporciona una interfaz de usuario al usuario en una red de comunicaciones (por ejemplo, una interfaz de usuario basada en World Wide Web), que contiene campos de entrada para la información requerida por en el análisis en silico (por ejemplo, la secuencia de la secuencia objetivo candidato). El uso de una ¡nterfaz de usuario basado en la Web íiene varias veníajas. Por ejemplo, proporcionando un mago de entrada, la ¡nterfaz de usuario puede asegura que el usuario introduzca la cantidad necesaria de información en el formato correcto. En algunas modalidades, la interfaz de usuario requiere que la información de la secuencia para una secuencia objetivo sea de una longitud mínima (por ejemplo, 20 o más, 50 o más, 100 o más nucleótidos) y sea de un solo formato (por ejemplo, FASTA). En otras modalidades, la información puede introducirse en cualquier formato y los sistemas y métodos de la presente invención editan o alteran la información de entrada en una forma adecuada para el análisis. Por ejemplo, si una secuencia objetivo de entrada es demasiado corta, los sistemas y métodos de la presente invención buscan las bases de datos públicas para la secuencia corta, y si se identifica una secuencia única, convierten la secuencia corta en una secuencia adecuadamente larga agregando nucleótidos en uno o ambos de los extremos de la secuencia objetivo de entrada. Asimismo, si la información de la secuencia se introduce en un formaío indeseable o de contenido extraño, los caracteres sin secuencia, la secuencia puede modificarse a un formato estándar (por ejemplo, FASTA) antes de otro análisis en silico. La ¡nterfaz de usuario puede también recolectar la información sobre el usuario, incluyendo, pero sin limitarse a, el nombre y dirección del usuario. En algunas modalidades, las entradas de la secuencia objetivo se asocian con un código de identificación del usuario. En algunas modalidades, las secuencias se introducen directamente desde el software diseñado para el ensayo (por ejemplo, el software INVADERCREATOR). En modalidades preferidas, cada secuencia se da en un número de ID. El número de ID se enlaza a la secuencia objetivo que es analizada para evitar ensayos duplicados. Por ejemplo, si en análisis in silico se determina que una secuencia objetivo que corresponde a la secuencia de entrada ya se ha analizado, el usuario es informado y proporciona la opción de pasar (by-passing) en el análisis en silico y simplemente recibe los resultados previamente obtenidos. Sistemas y Métodos de Ordenación en la Web Los usuarios que desean ordenar ensayo de detección, íienen un ensayo de defección diseñado, o de nuevo tener acceso a las bases de datos u otra información de la presente invención pueden utilizar un sistema de comunicación electrónico (por ejemplo, la Interneí). En algunas modalidades, un sisíema ordenador y de información de la presente invención se conecta a una red pública para permitir a cualquier usuario tener acceso a la información. En algunas modalidades, se proporcionan redes de comunicaciones electrónicas privadas. Por ejemplo, donde un cliente o usuario es un cliente repetiíivo (por ejemplo, un disíribuidor o laboratorio de diagnóstico grande), la conexión privada dedicada de tiempo completo puede proporcionarse entre un sistema de computadora del cliente y un sistema de computadora de los sistemas de la presente invención. El sistema puede arreglarse minimizar la interacción humana. Por ejemplo, en algunas modalidades, el software control inventario se utiliza para monitorear el número y tipo de ensayo de defección en la posesión del clienfe. Una pregunía se envía a intervalos definidos para determinar si el cliente tiene el número apropiado y tipo de ensayo de detección, y si se detectan las ausencias, las instrucciones se envían al diseño, producen, y/o suministran los ensayos adicionales al cliente. En algunas modalidades, el sistema también monitorea los niveles de inveníario del vendedor y en las modalidades preferidas, se integra con los conjuntos de producción para manejar la capacidad de producción y sincronización. En algunas modalidades, se proporciona una interfaz amigable para el usuario para facilitar la selección y ordenación de los ensayo de detección. Debido a los centenares de millares de ensayos de detección disponible y/o polimorfismos que el usuario puede desear para interrogar, la ¡nterfaz amigable para el usuario permite la navegación a través del conjunto complejo de opción. Por ejemplo, en algunas modalidades, una serie de bases de datos apiladas se utiliza para guiar a los usuarios a los productos deseados. En algunas modalidades, la primera capa proporciona una exhibición de todos los cromosomas de un organismo. El usuario selecciona el cromosoma o cromosomas de interés. La selección del cromosoma proporciona un mapa más detallado del cromosoma, indicando las regiones de unión en el cromosoma. La selección de la banda deseada conduce a un mapa que muestra las localizaciones del gen. Unas o más capas adicionales de detalle proporcionan las posiciones base de los polimorfismos, nombres del gen, marcados de identificación de la base de datos del genoma, anotaciones, regiones del cromosoma con ensayos de detección desarrollados preexisteníes que esíán disponibles para la compra, regiones donde ningún ensayo desarrollado preexisíenfe exisfe pero que están disponibles para el diseño y producción, etc. Seleccionando una región, polimorfismo, o ensayo de detección llevando al usuario a un interfaz de ordenación, donde la información se recolecta para iniciar el diseño del ensayo de detección y/u ordenación. En algunas modalidades, se proporciona un procesador de búsqueda, donde un nombre del gene, intervalo de secuencia, polimorfismo u otra pregunta se introduce más inmediatamenie direcío del usuario a la capa apropiada de información. En algunas modalidades, la ordenación, diseño, y sisíemas de producción se integran con un sistema de finanzas, donde la cotización del ensayo de defección es deíerminada por uno o más facíores: si o no el diseño es requerido, el cosió de mercancías basado en los componeníes en el ensayo de detección, descuentos especiales para cieríos clientes, descuentos para órdenes a granel, descuentos para reordenar, el precio aumenta donde el producto es cubierto por la propiedad intelectual u obligaciones contractuales de pago a terceros, y selección de precio basado en uso. Por ejemplo, donde los ensayos de detección se utilizan para o se certifican para diagnósticos clínicos, más que las solicitudes de búsqueda, la coíización se incrementa. En algunas modalidades, la coíización aumenía para los producios clínicos que ocurren automáticamente.

Por ejemplo, en algunas modalidades, los sistemas de la presente invención se enlazan al FDA, publicación pública, u otras bases de datos para determinar si un producto se ha ceríificado medianíe el diagnósfico clínico o uso de ASR. EJEMPLOS Se proporcionan los siguieníes ejemplos para demosírar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades preferidas y aspectos de la presente invención y no deben interpretarse como que limitan el alcance de la misma. En la descripción experimental que sigue, las siguienies abreviafuras se aplican: N (normal); M (molar); mM (milimolar); µM (micromolar); mol (moles); mmol (milimoles); µmoi (micromoles); nmol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramos); mg (miligramos); µg (microgramos); ng (nanogramos); I o L (liíros); mi (mililitros); µl (microlitros); cm (cenfímefros); mm (milímetros); µm (micrómetros); nm (nanómetros); DS (sulfato del dextrán); C (grados Ceniígrados); y Sigma (Sigma Chemical Co., Sí. Louis, MO). EJEMPLO 1 DESIGNAR UN 10-PLEX (MANUAL): PRUEBA PARA ENSAYOS INVADER El siguiente ejemplo experimental describe el diseño manual de los cebadores de amplificación para una reacción de amplificación múltiple, y la detección subsiguiente de los amplicones mediante el ensayo INVADER.

Diez secuencias objetivo se seleccionaron de un conjunto de secuencias que contienen SNP pre-validadas, disponible en un oligonucleótido interno de TWT para entrar en la base de datos. Cada objetivo contiene un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) al cual un ensayo INVADER se ha diseñado previamente. Los oligonucleótidos del ensayo INVADER se diseñaron mediante el software INVADER CREADOR (Third Wave Technologies, Inc. Madison, Wl), así la región de huella digital en este ejemplo se define la "huella digital" INVADER, o las bases cubiertas por el INVADER y los oligonucleótidos de sonda, óptimamente colocados para la detección de la base de interés, en este caso, un polimorfismo de un solo nucleótido. Aproximadamente 200 nucleótidos de cada una de las 10 secuencias objetivo se analizaron para el análisis de diseño del cebador de amplificación, con la base de SNP que reside en el centro de la secuencia. Se define el criterio de la longifud de sonda máxima y mínima (predeíerminados de 30 nucleóíidos y 12 nucleóíidos, respecíivamenfe), así como un ¡níervalo para la temperatura de fusión de sonda Tm de 50-60°C. En este ejemplo, para seleccionar una secuencia de sonda que se realice óptimameníe a una íemperaíura de reacción preseleccionada, la temperatura de fusión (Tm) del oligonucleótido se calcula utilizando el modelo vecino más cercano y parámetros publicados para el ADN duplican la formación (Allawi and SantaLucia, Biochemisíry, 36:10581

[1997], en la presente se incorpora por referencia). Debido a que las concentraciones de sal del ensayo son a menudo diferentes de la solución, las condiciones en las cuales se obtuvieron los parámetros del vecino más cercano (NaCI 1M y ninguno de los metales divalentes), y debido a que la presencia y conceníración de la íemperafura de reacción ópíima de influencia de la enzima, un ajuste se debe hacer para la Tm calculada para determinar la temperatura óptima en la cual se realiza una reacción. Una forma de compensar estos factores es variar el valor proporcionado para la concentración de sal dentro de los cálculos de temperaíura de fusión. Esfe ajusíe se denomina una 'corrección de sal'. El íérmino "corrección de sal" se referir a una variación hecha en el valor proporcionado para una conceníración de sal con el fin reflejar el efecío en un cálculo de Tm para uno ácido nucleico dúplex de un parámetro son sal o condición que afectar dúplex. La variación de los valores proporcionados para las concentraciones de la hebra también afectará el resultado de estos cálculos. Utilizando un valor de NaCI 280 nM (SantaLucia, Proc Nati Acad Sci U.S. A, 95:1460

[1998], incorporado en la presente por referencia) y las concentraciones de hebra de aproximadamente 10 pM la sonda y 1 fM objetivo, el algoritmo utilizado para calcular la temperaíura de fusión de sonda-objeíivo se ha adapíado para uso en predecir las secuencias de diseño del cebador ópíimas. Después, la secuencia adyaceníe a la región de huella digital, se exploraron la corriente arriba y corriente abajo y la primera A o C se eligieron para el inicio del diseño tal que los cebadores descritos como 5'-N[x]-N[x-1]- -N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3', donde N[1] debe ser una A o C. El cebador complementario es evitado utilizando la regla de: N[2]-N[1] de un cebador de oligonucleótido dado no debe ser complementario de N[2]-N[1] de ningún otro oligonucleótido, y N[3]-N[2]-N[1] no debe ser complementario a N[3]-N[2]-N[1] de ningún otro oligonucleótido. Si estos criterios no se cumplieron en un N[1] dado, la siguiente base en la dirección 5' para el cebador directo o la siguiente base en la dirección 3' para el cebador inverso se evaluará como un sitio N[1]. En el caso del análisis manual, las regiones ricas de A/C se marcaron para minimizar la complemeníariedad de los exíremos 3'. En esíe ejemplo, un ensayo INVADER se realizó después de la reacción de amplificación múlüple. Por lo íanío, una sección del oligonucleóíido de reacción INVADER secundario (la secuencia del oligonucleótido de FRET) también se incorpora como el criterio para el diseño del cebador; la secuencia del cebador de amplificación debe ser menor de 80% del homólogo a la región especificada del oligonucleótido de FRET. Todos los cebadores se sinteíizaron de acuerdo a la química del oligonucleóíido esíándar, desalados (por méíodos esíándares) y cuantificados por absorbencia a A260 y diluidos en reservas de 50 µM concentradas. La PCR múltiplex (polimerasa de amplificación múltiple) entonces se lleva a cabo utilizando PCR 10-plex utilizando cantidades equimolar del cebador (0.01 uM/cebador) bajo las siguientes condiciones; KCI 100 mM, MgCI2 3 mM, Tris 10 mM pH 8.0, dNTPs 200 uM, Taq ADN polimerasa 2.5 U, y 10 ng del patrón de ADN genómico humano (hgADN) en una reacción 50 ul. La reacción se incubó (94C/30sec, 50C/44sec.) durante 30 ciclos. Después de la incubación, la reacción del PCR múltiplex se diluyó 1:10 con agua y se sometió al ensayo INVADER utilizando las INVADER Assay FRET Detecíion Piafes, genómico biplex de 96 pozos, 100 ng de la enzima CLEAVASE VIII, el ensayo INVADER se formuló como 15 ul de reacciones como sigue; 1 ul de dilusión 1:10 de la reacción de PCR, 3 ul de la mezcla de PPI, 5 ul de MgCI2 22.5 mM, 6 ul de dH20, cubierto con 15 ul de cera líquida de CHILLOUT. Las muestras se desnaturalizaron en el INVADER dúplex mediante incubación a 95C durante 5 min., seguido por la incubación a 63C y fluorescencia medida en un Cytofluor 4000 a varios puntos de íiempo. Uíilizando los siguienfes criferios para hacer exacíameníe el genotipo llamado (FOZ_FAM + FOZ_RED-2>0.6), solamente 2 de los 10 ensayos INVADER llamados pueden hacerse después de 10 minutos de incubación a 63C, y solamente 5 de los 10 llamados podrán hacerse después de 50 minuíos adicionales de incubación a 63C (60 min.). En el punto de tiempo de 60 minutos, la variación entre los valores FOZ detectables está sobre 100 veces entre la señal más fuerte (41646, FAM_FOZ+RED_FOZ-2=54.2, que también es la externa lejana del intervalo dinámico del lector) y la señal más débil (67356, FAM_FOZ+RED_FOZ-2 = 0.2). Utilizando los mismos ensayos INVADER directameníe coníra 100 ng del ADN genómico humano (donde las cantidades equimolares de cada objetivo estarán disponibles), todas las lecturas podrán hacerse con en el intervalo dinámico del lector y la variación en los valores de FOZ fue aproximadamente sieíe veces entre el más fuerte (53530, FAM_FOZ+RED_FOZ-2 = 3.1) y más débil (53530, FAM_FOZ+RED_FOZ-2=0.43) de los ensayos. Esto sugiere que las discrepancias dramáticas en los valores de FOZ considerados eníre difereníes amplicones en la misma reacción de PCR múlíiplexx sean una función de la amplificación desviada, y ninguna variabilidad aíribuible al ensayo INVADER. Bajo estas condiciones, los valores de FOZ generados por diferentes ensayos INVADER son directameníe comparables con oíros y pueden uíilizarse confiablemeníe como indicadores de la eficacia de la amplificación. Estimación del factor de amplificación de un amplicón dado utilizando los valores de FOZ. Para esíimar el facior de amplificación (F) de un amplicón dado, los valores de FOZ del ensayo INVADER puede uíilizarse para esíimar la abundancia del amplicón. Los FOZ de un amplicón dado con la conceníración desconocida en un momento dado (FOZm) pueden compararse directamente con los FOZ de una cantidad conocida del objetivo (por ejemplo 100 ng del ADN genómico = 30,000 copias de un solo gen) en un punto definido en fiempo (FOZ240, 240 minuíos) y uíilizados para calcular el número de copias del amplicón desconocido. En la ecuación 1, FOZm represenía la suma de RED_FOZ y FAM_FOZ de una concentración desconocida del objetivo incubado en un ensayo INVADER para una cantidad dada de tiempo (m). FOZ2 o representa un valor empíricamente determinado de RED_FOZ (utilizando el ensayo INVADER 41646), utilizado para un número conocido de copias del objetivo (por ejemplo 100 ng de hgADN = 30,000 copias) durante 240 minutos. F = ((FOZm-1)*500/(FOZ240-1))*(240/m)?2 (ecuación 1a) Aunque la ecuación 1a se utiliza para determinar la relación lineal entre la concentración del cebador y el factor de amplificación F, la ecuación 1a' se utiliza en el cálculo del factor de amplificación F para la PCR 10-plex (ambos con cantidades equimolares del cebador y concentraciones optimizadas del cebador), con el valor de D representando el factor de dilusión de la reacción de PCR. En el caso de una dilusión 1:3 de la reacción de PCR múltiplex 50 ul. D=0.3333. F = ((FOZm-2)*500/(FOZ240-1)*D)*(240/m)?2 (ecuación 1a') Aunque las ecuaciones 1a y 1a' se utilizan en la descripción de la PCR múltiplex 10-plex, una adaptación más correcta de esta ecuación se utiliza en la optimización de las conceníraciones del cebador en la PCR 107-plex. En este caso, el FOZ240=promedio de FAM_FOZ240+RED_FOZ240 sobre la placa MAPA INVADER completa utilizando hgADN como objetivo (FOZ240=3.42) y el factor de dilusión D se ajusta a 0.125. F = ((FOZm-2)*500/(FOZ240-2)*D)*(240/m)?2 (ecuación 1b) Debe observarse que en orden para la estimación del factor de amplificación F será más exacta, los valores de FOZ deben estar dentro del intervalo dinámico del instrumento en el cual se toma la lectura. En el caso del Cytofluor 4000 utilizado en esíe esíudio, el iníervalo dinámico esíuvo eníre aproximadameníe 1.5 y aproximadameníe 12 FOZ. Sección 3. Relación Lineal entre el Factor de Amplificación y Concentración del Cebador. Para deíerminar la relación eníre la concentración del cebador y el factor de amplificación (F), cuatro distintas reacciones de la PCR uniplex se produjeron utilizando los cebadores 1117-70-17 y 1117-70-18 en concentraciones de 0.01 uM, 0.012 uM, 0.014 uM, 0.020 uM respectivamente. Las cuatro reacciones de PCR independientes se produjeron bajo las siguientes condiciones; 100 mM de KCI, 3 mM de MgCI2, 10 mM de Tris pH 8.0, 200 uM de dNTPs utilizando 10 ng de hgADN como patrón. La incubación se llevó a cabo a (94C/30 sec, 50C/20 sec.) durante 30 ciclos. Después de la PCR, las reacciones se diluyeron 1:10 con agua y produjeron bajo condiciones estándares utilizando INVADER Assay FRET Detection Plates, genómico biplex de 96 pozos, 100 ng de enzima CLEAVASE VIII. Cada 15 ul de reacción se preparó como sigue; 1 ul de 1:10 de reacción de PCR diluida, 3 ul de la mezcla PPI SNP#47932, 5 ul de MgCI2 22.5 mM, 6 ul de agua, 15 ul de cera líquida CHILLOUT. La placa compleía se incubó a 95C duranfe 5 min, y después a 63C durante 60 min en tal punto se tomó una solo lectura en un lector de placa fluorescente Cytofluor 4000. Para cada una de las cuatro diferentes concentraciones del cebador (0.01 uM, 0.012 uM, 0.014 uM, 0.020 uM) el factor de amplificación F se calculó utilizando la ecuación 1a, con FOZm=la suma de FOZ_FAM y FOZ_RED duraníe 60 minutos, m=60, y FOZ24o=1.7. En la graficación de la concentración del cebador de cada reacción contra el log del factor de amplificación Log(F), se observó una relación lineal fuerte. Utilizando estos puntos de datos, la fórmula que describe la relación lineal entre el factor de amplificación y la concentración del cebador se describe en la ecuación 2: Y=1.684X+2.6837 (ecuación 2a) Uíilizando la ecuación 2, el facíor de amplificación de un amplicón dado Log(F)=Y se podrá manipular de una manera predecible uíilizando una conceníración conocida del cebador (X). De una manera inversa, la inclinación de la amplificación se observó bajo condiciones de las conceníraciones del cebador equimolar en la PCR múlíiplex, podrá medirse como la conceníración del cebador "evidenfe" (X) basada en el factor de amplificación F. En la PCR múltiplex, los valores de la concentración del cebador "evidente" entre diferentes amplicones puede utilizarse estimar la cantidad de cebador de cada amplicón requerido para igualar la amplificación de diferentes 1 oci: X=(Y-2.6837)/1.68 (ecuación 2b) Sección 4. Cálculo de las Concentraciones del Cebador Aparente de una Mezcla del múltiple equilibrado Como se describe en una sección anterior, la concentración del cebador puede influenciar directamente el factor de amplificación del amplicón dado. Bajo condiciones de cantidades equimolares de cebadores, las lecíuras de FOZm pueden uíilizarse para calcular la conceníración del cebador "evideníe" de cada amplicón uíilizando la ecuación 2. Susíifuyendo Y en la ecuación 2 por log(F) de un facíor de amplificación dado y solucionándola para X, da una conceníración del cebador "evidenfe" basada en la abundancia relaíiva de un amplicón dado en una reacción múlüple. Uíilizando la ecuación 2 para calcular la conceníración del cebador "evideníe" de iodos los cebadores (proporcionadas en la concenfración equimolar) en una reacción múltiple se proporciona un medio de normalizar los conjuntos de cebadores entre sí. Para derivar las cantidades relativas de cada cebador que deben agregarse a una mezcla del cebador múltiple R "Optimizado", cada una de las concentraciones del cebador "evidente" deben dividirse en la concentración del cebador evidente máxima (Xma?), tal que el amplicón más fuerte se ajusta a un valor de 1 y los amplicones restantes a valores iguales o mayores de 1 (ecuación 3) Utilizando los valores de R[n] como un valor arbitrario de la concentración del cebador relativa, los valores de R[n] se multiplican por una concentración del cebador constante para proporcionar las concentraciones de trabajo para cada cebador en una reacción múltiple dada. En el ejemplo mostrado, el amplicón que corresponde al ensayo de SNP 41646 tiene un valor R[n] igual a 1. Todos los valores R[n] se multiplicaron por 0.01 uM (la concentración del cebador que inicia originalmente en la reacción de PCR múltiplex equimolar) tal que la concentración del cebador menor es R[n] de 41646 que se ajusta a 1, u 0.01 uM. Los conjuntos del cebador restantes también se incrementaron proporcionalmente. Los resultados de la PCR múltiplex con la mezcla del cebador "optimizada" se describen abajo. Sección 5 Usando concentraciones del cebador optimizadas en PCR múltiplex, la variación en FOZ's entre 10 ensayos INVADER se reduce mayormente. La PCR múltiplex se llevó a cabo utilizando la PCR 10-plex utilizando cantidades variantes del cebador basadas en los volúmenes (X[max] fue SNP41646, ajusfando 1x=0.01 uM/cebador). La PCR múltiplex se llevó a cabo bajo condiciones idénticas a las usadas con la mezcla del cebador equimolar;100 mM de KCI, 3 mM de MgCI, 10 mM de Tris pH 8.0, 200 uM de dNTPs, 2.5U taq, y 10 ng de patrón de hgADN en 50 ul de una reacción. La reacción se incubó durante (94C/30 sec, 50C/44 sec.) durante 30 ciclos. Después de la incubación, la reacción de PCR múltiplex se diluyó 1:10 con agua y se sometió a ensayo INVADER. Utilizando INVADER Assay FRET Detection Plates, (genómico biplex de 96 pozos, 100 ng de enzima CLEAVSE VIII), las reacciones se formularon como 15 ul de reacciones como sigue; 1 ul de la dilusión 1:10 de la reacción de PCR, 3 ul de la mezcla PPI apropiada, 5 ul de MgCI2 22.5 M, 6 ul de dH20. 15 ul adicionales de CHILL OUT se agregó a cada pozo, seguido por la incubación a 95C durante 5 min. Las placas se incubaron a 63C y fluorescencia medida en un Cytofluor 4000 durante 10 minutos. Utilizando los siguientes criterios para hacer exactamente el genotipo llamado (FOZ_FAM + FOZ_RED-2>0.6), todos 10 de 10 (100%) llamados INVADER pueden hacerse después de 10 minutos de incubación a 63C. Además, los valores de FAM + RED-2 (un indicador de la generación de la señal completa, relacionada directameníe con el facíor de amplificación (ver ecuación 2)) variando por lo menos siete veces entre la señal menor (67325, FAM + RED-2 = 0.7) y la mayor (47892, FAM + RED-2=4.3). EJEMPLO 2 DISEÑO DE PCR 101-PLEX UTILIZANDO LA APLICACIÓN DEL SOFTWARE Utilizando la TWT Oligo Order Entry Datábase, se obtuvieron 144 secuencias de menos de 200 nucleótidos en longitud, con SNPs anotados utilizando los soportes para indicar la posición de SNP para cada secuencia (por ejemplo NNNNNNN[N(wt)/N(mt)]NNNNNNNN). Para agrandar los datos de la secuencia que flanquean la SNP de interés, las secuencias se agrandaron a aproximadamente 1kB en longitud (500 nts que flanquean cada lado de la SNP) que utiliza el análisis de BLAST. De las 144 secuencias que inician, 16 no podrán agrandarse por BLAST, dando por resultado un ajuste final de 128 secuencias agrandadas a aproximadamente 1kB de longitud. Estas secuencias agrandadas se proporcionaron al usuario en el formato Excel con la siguiente información para cada secuencia; (1) Número de TWT, (2) Identificador Nombre Corío, y (3) secuencia. El archivo Excel se conviríió a un formaío delimiíado coma y ufilizado como el archivo de entrada para el software de Primer Designer INVADER CREATOR v1.3.3. (esta versión del programa no está clasificada para la reactividad de FRET de los cebadores, ni permite al usuario especificar la longitud máxima del cebador). El Primer Designer INVADER CREATOR v1.3.3., se activa utilizando las condiciones predeterminadas (por ejemplo tamaño del cebador mínimo de 12, máximo de 30), con la excepción de Trribaja que se ajustó a 60C. El archivo de salida contuvo 128 conjuntos de cebadores (256 cebadores), cuatro de los cuales se expulsaron debido a las secuencias del cebador excesivamente largas (SNP # 47854, 47889, 54874, 67396), saliendo de 124 conjuntos de cebadores (248 cebadores) disponibles para la síntesis. Los cebadores restaníes se sintetizaron utilizando procedimientos estándares en la escala 200 nmol y se purificaron mediante desalinización. Después de las predeterminaciones de la síntesis, 107 conjuntos de cebadores se ensamblaron de una mezcla del cebador equimolar 107-plex (214 cebadores). De los 107 conjuntos de cebadores disponibles para la amplificación, solamente 101 están presentes en la placa INVADER MAPA para evaluar el factor de amplificación. La PCR múltiplex se llevó a cabo utilizando la PCR 101-plex utilizando cantidades equimolares del cebador (0.025 uM/cebador) bajo las siguieníes condiciones; 100 mM de KCI, 3 mM de MgCI2, 10 mM de Tris pH 8.0, 200 uM de dNTPs, y 10 ng del patrón de ADN genómico humano (hgADN) en 50 ul de una reacción. Después de la desnaíuralización a 95C duraníe 10 min, 2.5 unidades de Taq se agregaron y la reacción se incubó (94C/30 sec, 50C/44 sec.) durante 50 ciclos. Después de la incubación, la reacción de la PCR múltiplex se diluyó 1:24 con agua y se sometió a análisis de ensayo INVADER utilizando la plataforma de la detección INVADER MAP. Cada ensayo INVADER MAP se activó como 6 ul de una reacción como sigue; 3 ul de dilusión 1:24 de la reacción de PCR (dilusión total 1:8 igual que D=0.125), 3 ul de MgCI2 15 mM cubiertos con 6 ul de CHILLOUT. Las muestras se desnaturalizaron en la placa MAP INVADER mediante incubación a 95C durante 5 min., seguido por la incubación a 63C y fluorescencia medida en un Cytofluor 4000 (lector de 384 pozos) a varios puntos de tiempo durante 160 minutos. El análisis de los valores de FOZ se calculó en 10, 20, 40, 80, 160 minutos, mostrando que las llamadas correctas (comparadas a las llamadas genómicas de la misma muestra de ADN) podrán hacerse para 94 de los 101 amplicones detecíables por la plaíaforma INVADER MAP. Esío proporciona la prueba que el sofíware INVADER CREATOR Primer Designer puede crear conjuníos de cebadores que funcionen en la PCR alíameníe múliiple. Uíilizando los valores de FOZ obtenidos a través del curso de tiempo de 160 min., el factor de amplificación F y R[n] se calculó para cada uno de los 101 amplicones. R[nmax] se ajustó en 1.6, donde las correcciones de exíremo Low se hicieron para los amplicones que no pudieron proporcionar suficieníe señal de FOZm a 160 min., asignando un valor arbiírario de 12 para R[n]. Las correcciones de exfremo superior para los amplicones que FOZm valora en los 10 min. leen, un valor de R[n] de 1 se asignaron arbiírariameníe. Las concentraciones del cebador optimizadas del 101-plex se calcularon utilizando los principios básicos descritos en el ejemplo 10-plex y la ecuación 1b, con un R[n] de 1 que corresponde al cebador 0.025 uM (ver Figura 15 para varias concentraciones del cebador). La PCR múltiplex fue bajo las siguientes condiciones; 100 mM de KCI, 3 mM de MgCI2, 10 mM de Tris pHd.O, 200 uM de dNTPs, y 10 ng del patrón de ADN genómico humano (hgADN) en 50 ul de una reacción. Después de la desnaturalización a 95C durante 10 min, 2.5 unidades de Taq se agregaron y la reacción se incubó (94C/30 sec, 50C/44 sec.) durante 50 ciclos. Después de la incubación, la reacción PCR múltiplex se diluyó 1:24 con agua y se sometió al análisis INVADER utilizando la plataforma de detección INVADER MAP. Cada ensayo INVADER MAP se activó como 6 ul de una reacción como sigue; 3 ul de la dilusión 1:24 de la reacción de PCR (dilusión toíal 1:8 igual que D = 0.125), 3 ul de MgCI2 15 mM cubieríos con 6 ul de CHILLOUT. Las muesíras se desnafuralizaron en la placa INVADER MAP medianíe incubación a 95C duraníe 5 min., seguido por incubación a 63C y fluorescencia medida en un Cyíofluor 4000 (lecíor de 384 pozos) a varios puntos de tiempo duraníe 160 minutos. El análisis de los valores de FOZ se llevó a cabo en 10, 20 y 40 min y se comparó con las llamadas hechos directameníe contra el ADN genómico. Se hizo la comparación entre las llamadas hechas en 10 min. con una PCR 101-plex con las concenfraciones del cebador equimolares contra las llamadas que se hicieron en 10 min. con un PCR 101-plex activado bajo concentraciones del cebador optimizado. Bajo la concentración del cebador equimolar, la PCR múltiplex da lugar a solamente 50 llamadas correctas en el punto de tiempo de 10 minutos, donde bajo las concentraciones del cebador optimizado de la PCR múltiplex resultan en 71 llamadas correctas, dando por resultado un incremento de 21 nuevas llamadas (42%). Aunque todas las 101 llamadas no podrán hacerse en el punfo de íiempo de 10 minutos, 94 llamadas podrán hacerse en el punto de tiempo de 40 min. que sugiere que la eficiencia de amplificación de la mayoría de los amplicones ha mejorado. A diferencia de la optimización de 10-plex que solamente requirió una sola ronda de optimización, las rondas múltiples de optimización pueden requerirse para reacciones de la multiplexación más complejas para balancear la amplificación de todos los loci (sitio). EJEMPLO 3 USO DEL ENSAYO INVADER PARA DETERMINAR EL FACTOR DE AMPLIFICACIÓN DE PCR El ensayo INVADER puede utilizarse para monitorear el progreso de la amplificación durante las reacciones de PCR, es decir, para determinar el factor de amplificación F que refleja la eficiencia de la amplificación de un amplicón particular en una reacción. En particular, el ensayo INVADER puede utilizarse para determinar el número de moléculas presentes en cualquier punto de una reacción de PCR mediante la referencia a una curva estándar generada de las moléculas de ADN de referencia cuantificadas. El factor de amplificación F se mide como una proporción de concentración del producto de PCR después de la amplificación para la concentración objetivo inicial. Este ejemplo demuestra el efecto de variación de la concentración del cebador en el factor de amplificación medido. Las reacciones de PCR se condujeron para números variables de ciclos en incrementos de 5, es decir, 5, 10, 15, 20, 25, 30, de modo que el progreso de la reacción se pudiera determinar utilizando el ensayo INVADER para medir el producto acumulado. Las reacciones se diluyeron en serie para asegurar que las cantidades objetivo no saturaran el ensayo INVADER, es decir, de modo que las medidas se pudieran hacer en el intervalo lineal del ensayo. Las curvas estándares del ensayo INVADER se generaron utilizando una serie de diluciones que contienen cantidades conocidas del amplicón. Esta curva estándar se utilizó para extrapolar el número de fragmentos de ADN amplificados en reacciones de PCR después del número indicado de ciclos. La proporción del número de moléculas después de un número dado de ciclos de PCR al número presente antes de la amplificación se utiliza para derivar el factor de amplificación, F, de cada reacción de PCR. Reacciones de PCR Las reacciones de PCR se prepararon utilizando cantidades equimoiares de cebadores (por ejemplo, 0.02 µM o 0.1 µM de cebadores, concentración final). Las reacciones en cada concentración del cebador se prepararon por triplicado para cada nivel de la amplificación probada, es decir, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 ciclos de PCR. Una mezcla principal suficiente para 6 reacciones de PCR estándares (cada una en triplicado X 2 concentraciones del cebador) más 2 controles X 6 pruebas (5, 10, 15, 20, 25 ó 30 ciclos de PCR) más suficiente para las reacciones extras para permitir el excedente.

Diluciones seriales de productos de reacción de PCR Para asegurar que la cantidad del producto de PCR agregada como objetivo a las reacciones del ensayo de INVADER no exceda el intervalo dinámico del ensayo en tiempo real en los PERSEPTIVE BIOSYSTEMS CYTOFLUOR 4000, los productos de la reacción de PCR se diluyeron antes de la adición a los ensayos INVADER. Se hizo una dilusión 20-veces inicial de cada reacción, seguido por diluciones seriales cinco-veces subsiguientes. Para crear estándares, los productos de amplificación generados con los mismos cebadores usados en las pruebas de diferentes números de ciclos se aislaron a partir de geles de poliacrilamida no-desnaturalizados utilizando métodos estándares y cuantificados uíilizando el ensayo de PICOGREEN. Se creó una reserva de írabajo de 200 pM, y se crearon las diluciones seriales de esíos esíándares de conceníración en dH20 que coníiene íRNA a 30 ng/µl para proporcionar unas series con concentraciones del amplicón finales de 0.5, 1, 2.5, 6.25, 15.62, 39 y 100 fM. Reacciones del ensayo INVADER Las diluciones apropiadas de cada reacción de PCR y el control objetivo se hicieron por íriplicado, y probaron en reacciones del ensayo INVADER esfándar, en singlicaío. Se hizo una mezcla principal para fodas las reacciones del ensayo INVADER. En iodos, hubo 6 condiciones del ciclo de PCR X 24 ensayos de prueba individuales [(1 prueba de diluciones por triplicado X 2 condiciones del cebador X 3 réplicas de PCR) = 18 + 6 ninguno de los controles objetivo]. La adición, aquí fue de 7 diluciones de los estándares del amplicón cuantificado y 1 conírol no objetivo en las series estándar. Las series estándar se analizaron en replicar cada una de las dos placas, para 32 ensayos INVADER adicionales. El número toíal de ensayos INVADER es 6 x 24 + 32 = 176. La mezcla principal incluyó la cobertura durante 32 reacciones. La mezcla principal del ensayo INVADER y que comprende los siguiente componentes estándapamortiguador FRET/Cleavase XI/Mg/mezcla de PPl para 192 más de 16 pozos. Los siguientes oligonucleótidos se incluyen en la mezcla de PPl. 0.252 µM de INVADER para el ensayo 2 (GAAGCGGCGCCGGTTACCACCA) 2.52 µM de una sonda A para el ensayo 2 (CGCGCCGAGGTGGTTGAGCAATTCCAA) 2.52 µM de sonda G para el ensayo 2 (ATGACGTGGCAGACCGGTTGAGCAATTCCA) Todos los pozos se recubren con 5/µl de aceite mineral, se incubaron a 95°C durante 5 minutos, después a 63°C se leyeron a varios intervalos, por ejemplo 20, 40, 80 ó 160 minutos, dependiendo del nivel de la señal generada. La placa de reacción se leyó en un CytoFluor® Series 4000 Fluorescence Multi-Well Píate Reader. Los ajustes utilizados fueron: 485/20 nm de excitación/ancho de banda y 530/25 nm de emisión/ancho de banda para la detección de tinfe F, y 560/20 nm de excifación/ancho de banda y 620/40 nm de emisión/ancho de banda para la defección de íiníe R. El medio logrado se indica para cada íiníe de modo que el No Targeí Blank producido eníre 100 — 200 Absoluíe Fluorescence Uniís (AFUs). Resultados: Cuando los resultados de los ensayos INVADER triplicados se diagramaron en un diagrama de log10 del factor de amplificación (eje y) como una función de número de ciclo (eje x), la concentración del producto de PCR se esíimó a paríir de los ensayos INVADER medianíe la exírapolación de la curva esíándar. Los daíos de los ensayo replicados no se promediaron sino que por el conírario se preseníaron como los punios múlíiples, sobrepuestos en la figura. Estos resultados indican que las reacciones de PCR son exponenciales sobre el intervalo de los ciclos probados. El uso de diferentes concentraciones del cebador dio lugar a diferentes inclinaciones tal que el inclinación generado del análisis de ensayo INVADER de las reacciones de PCR se llevaron a cabo con la concentración de cebador mayor (0.1 µM) es más pronunciado que con la concentración menor (0.02 µM). Además, el inclinación obtenido utilizando 0.1 µM de los métodos que se anticiparon para ei doblado perfecto (0.301). Los factores de amplificación de las reacciones de PCR en cada concentración del cebador se obtuvieron de las inclinaciones: Para 0.1 µM de cebadores, inclinación = 0.286; factor de amplificación: 1.93 Para 0.02 µM de cebadores, inclinación = 0.218; factor de amplificación: 1.65. Las líneas no parecen extenderse al origen sino que intercepían el eje x eníre 0 y 5 ciclos, posiblemeníe reflexivo de errores en esíimar la conexión de inicio del ADN genómico humano. Así, estos datos muestran que la concentración del cebador afecta el grado de amplificación duraníe la reacción de PCR. Estos datos además muestran que el ensayo INVADER es una herramienta efectiva para monitorear la amplificación a través de la reacción de PCR. EJEMPLO 4 DEPENDENCIA DEL FACTOR DE AMPLIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL CEBADOR Este ejemplo demuestra la correlación entre el factor de amplificación, F, y la concentración del cebador, c. En este experimento, F fue determinada para 2 alelos de cada uno de 6 SNPs amplificados en reacciones de PCR monoplex, cada uno en 4 diferentes concentraciones del cebador, por lo tanío 6 pares del cebador X 2 muesfras genómicas X 4 conceníraciones del cebador = 48 reacciones de PCR. Mieníras que el efecío del número de ciclo de PCR se probó en una sola región amplificada, en dos conceníraciones del cebador, en el Ejemplo 3, en esíe ejemplo, íodas las reacciones de PCR de prueba se acíivaron por 20 ciclos, pero el efecío de variar la conceníración del cebador se esíudió en 4 niveles de conceníración difereníes: 0.01 µM, 0.025 µM, 0.05 µM, 0.1 µM. Además, esíe experimenío examina las diferencias en la amplificación de difereníes regiones genómicas para investigar (a) si difereníes regiones genómicas son amplificadas a difereníes grados (es decir inclinación de PCR) y (b) cómo la amplificación de difereníes regiones genómicas depende de la concentración del cebador. Como en el Ejemplo 3, F se midió generando una curva estándar para cada siíio que uíiliza series de diluciones de preparaciones del amplicón de referencia purificadas, cuanfificadas. En este caso, 12 diferentes amplicones de referencia se generaron: uno para cada alelo de los SNPs contenidos en las 6 regiones genómicas amplificadas por los pares de cebadores. Cada concentración del amplicón de referencia se probó en un ensayo INVADER, y se creó una curva estándar de los puntajes de fluorescencia contra la concentración del amplicón. Las reacciones de PCR también se activaron en las muestras de ADN genómico, los productos se diluyeron, y después se probaron en un ensayo INVADER para determinar el grado de la amplificación, en términos del número de moléculas, mediante la comparación a la curva estándar. a. Generación de curvas estándares que utilizan amplicones de referencia cuantificados Un toíal de 8 muestras de ADN genómicas aisladas de sangre entera se clasificaron en ensayos INVADER biplex estándares para determinar sus genotipos a 24 SNPs para identificar las muestras homocigosas para el alelo tipo silvestre o variante en un toíal de 6 difereníes loci. Una vez que esíos loci se ideníificaron, las muesíras de ADN genómicas íipo silvesíre y variables se analizaron en reacciones de PCR por separados con cebadores que flanquean la región genómica que coníiene cada SNP. En cada SNP, un alelo se reporta al tiníe de FAM y uno a RED. Las preparaciones de ADN genómico adecuadas eníonces se amplifican en reacciones de PCR monoplex individuales esíándar, para generar los fragmenfos amplificados para uso como estándares de referencia de PCR como se describe en el Ejemplo 3. Seguido de la PCR, el ADN amplificado fue gel aislado utilizando métodos estándares y cuantificado previameníe uíilizando el ensayo de P1COGREEN. Las diluciones seriales de estos estándares de concentración se crearon como sigue: Cada amplicón purificado se diluyó para crear una reserva de írabajo a una conceníración de 200 pM. Esías reservas después se diluyeron en serie como sigue. Una solución de reserva de írabajo de cada amplicón se preparó con una conceníración de 1.25 pM en dH20 que coníiene íRNA en 30 ng/µl. La reserva de írabajo se diluyó en placas de microíiíulación de 96-pozos y después se diluyó en serie para proporcionar las siguieníes conceníraciones finales en el ensayo INVADER: 1, 2.5, 6.25, 15.6, 39, 100 y 250 fM. Se preparó una placa para los amplicones a deíeciarse en el ensayo INVADER uíilizando oligonucleófidos de sonda reporían al íiníe FAM y una placa para los probados con oligonucleóíidos de sonda reportan al tiníe RED. Todas las diluciones del amplicón se analizaron por duplicado. Las alícuotas de 100 µl se transfirieron, en esta disposición, en placas de MJ Research de 96 pozos y desnaturalizadas durante 5 min a 95°C antes de la adición a los ensayos INVADER. b. Amplificación de PCR de muestras genómicas en diferentes concentraciones del cebador. Las reacciones de PCR se prepararon para la amplificación individual de las 6 regiones genómicas descritas en el ejemplo anterior en cada uno de los 2 alelos en 4 diferentes concentraciones del cebador, para un toíal de 48 reacciones de PCR. Todos los PCRs se acfivaron duraníe 20 ciclos. Las siguientes concentraciones del cebador se probaron: 0.01 µM, 0.025 µM, 0.05 µM y 0.1 µM. Una mezcla principal para todas las 48 reacciones se preparó de acuerdo a los procedimientos estándares, con la excepción de las concenfraciones del cebador modificadas, más los excedenfes para las 23 reacciones adicionales (16 reacciones se prepararon pero no se uíilizaron, y se preparó el excedeníe de 7 reacciones adicionales). c. Dilusión de reacciones de PCR Aníes del análisis por el ensayo INVADER, fue necesario diluir los producios de las reacciones de PCR, como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Las diluciones seriales de cada una de las 48 reacciones de PCR se hicieron uíilizando una placa de 96-pozos para cada SNP. La miíad izquierda de la placa contenía el SNPs a probarse con los oligonucleótidos de sonda reportan al FAM; la mitad derecha, con los oligonucleótidos de sonda reportan al RED. La dilusión inicial fue 1:20; las diluciones subsiguientes fueron 1:5 hasta 1: 62.500. d. Análisis de ensayo INVADER de diluciones de PCR y amplicones de referencia El análisis INVADER se llevó a cabo en todas las diluciones de los productos de cada reacción de PCR así como las diluciones indicadas de cada amplicón de referencia cuantificado (para generar una curva estándar para cada amplicón) en ensayos INVADER biplex estándares. Todos los pozos se recubrieron con 15 Iµ de aceite mineral. Las muestras se calentaron a 95°C durante 5 minutos para desnaturalizar y después se incubaron a 64°C. Las medidas de fluorescencia se tomaron a 40 y 80 minutos en un lector de placa de fluorescencia CytoFluor® 4000 (Applied Biosystems, Fosíer Ciíy, CA). Los ajusfes usados fueron: 485/20 nm excitación/ancho de banda y 530/25 funcionó emisión/ancho de banda para la detección del tinfe F, y 560/20 nm exciíación/ancho de banda y 620/40 nm emisión/ancho de banda para la defección del íiníe R. El incremenío del insírumento se ajustó para cada tinte de modo que el No Target Blank producido entre 100 - 200 Absolute Fluorescence Uniís (AFUs). Los daíos raw son los generados por el disposiíivo/insírumento usado para medir el rendimiento del ensayo (tiempo real o modo del punto final). Estos resultados indican que la dependencia de InF en c demuestra diferentes porcentajes de amplificación para los 12 PCRs bajo mismas condiciones de reacción, aunque la diferencia es mucho menor dentro de cada par de los objetivos que representan el mismo SNP. El factor de amplificación depende fuertemeníe de c en conceníraciones del cebador bajas con una íendencia para esfabilizar las conceníraciones del cebador mayores. Este fenómeno puede explicarse en íérminos de la cinefica del recocido del cebador. A conceníraciones del cebador alias, la cinefica de recocido rápida asegura que los cebadores se enlacen a todos los objetivos y la proporción de amplificación máxima es alcanzada, por el contrario, a concentraciones del cebador bajas la cinética de recocido del cebador se convierte en una etapa limitante de proporción que disminuye F. Este análisis sugiere eso que el factor de amplificación de \n(2- ) traza como una función de la concentración de cebador en contra las coordenadas c debe producir una línea recta con una inclinación -kata. La re-graficación de los datos enl«(2-/")contra las coordenadas c demuesíra la dependencia lineal previsía para las concenfraciones del cebador bajas (facíor de amplificación bajo) que desvía las linealidades en 0.1 µM de conceníraciones del cebador (F es 105 o mayor) debido a que son menores que el facíor de amplificación esperado. Los valores de kaía. pueden calcularse para cada PCR uíilizando la siguieníe ecuación. F = z"=(2-ek?? EJEMPLO 5 ANÁLISIS DEL ENSAYO INVADER DE LA REACCIÓN DE PCR 192- PLEX Esíe ejemplo describe el uso del ensayo INVADER para deíecíar los producios de una reacción de PCR alíameníe muliiplexada diseñada para amplificar 192 disíiníos loci en el genoma humano. Extracción del ADN Genómico El ADN genómico se aisla a paríir del 5 mis de sangre eníera y se purifica uíilizando el Auíopure, fabricado por Geníra Systems, Inc. (Minneapolis, MN). El ADN purificado fue en 500 µl de dH20. Diseño del cebador Los conjuntos de cebadores delantero e inverso para 192 loci se diseñaron utilizando el Primer Designer, versión 1.3.4 (Ver Primer Design sección anterior, incluyendo la Figura 8). Las secuencias objeíivo usadas para los diseños INVADER, sin más de 500 bases que flanquean el siíio de SNP relevanfe, se conviríieron en un archivo de íexío coma-delimiíado para uso como un archivo de enírada para el Primer Design. El Primer Design se acfivó uíilizando parámeíros predeíerminados, con la excepción del oligo Tm, que se ajusfó a 60 °C. Síntesis del cebador Los cebadores del oligonucleóíido se siníeíizaron ufilizando procedimientos estándares en un Polyplex (GeneMachines, San Carlos, CA). La escala fue 0.2 µmol, desalada solamente (no purificada) en NAP-10 y no secada más adelante. Reacciones de PCR Se crearon dos mezclas principales. La mezcla principal 1 contuvo los cebadores para amplificar loci 1-96; mezcla principal 2, 97-192. Se hicieron las mezclas de acuerdo a los procedimientos estándares y conteniendo los componentes esíándares. Todos los cebadores se presenían en una conceníración final de 0.025 µM, con KCI en 100 mM, y MgCI2 en 3 mM. Las condiciones de ciclización de PCR fueron como sigue en un íermocilcador MJ PTC-100 (MJ Research, Walíham, MA): 95°C durante 15 minutos; 94°C durante 30 sec, después a 55°C 44 sec X 50 ciclos. Siguiendo la ciclización, todas las 4 reacciones de PCR se combinaron y las alícuotas de 3 µl se distribuyeron en una placa de 384 pozos profunda uíilizando una esíación de pipeíación automatizada CYBI de 2000 pozos (CyBio AG, Jena, Germany). Este ¡nstrumenio hace las adiciones del reacíivo individuales para cada uno de los pozos de una microplaca de 384 pozos. Los reactivos a agregarse se colocan en placas de media profundas de 384 pozos. Reacciones de ensayo INVADER Los ensayos INVADER se prepararon uíilizando el CYBI de 2000 pozos. Las alícuoías de 3 µl de objeíivo del ADN genómico se agregaron a los pozos apropiados. Ninguno de los confroles objeíivo se comprendió de 3 µl de Te (10 mM de Tris, pH 8.0, EDTA 0.1 mM). Los reactivos para uso en los ensayos INVADER son mezclas de PPl estándar, amortiguador, oligonucleótidos de FRET, y enzima Cleavase VIII y se agregaron individualmente a cada uno de los pozos mediante el CYBI de 2000 pozos. Después de las adiciones del reactivo, 6 µl de aceite mineral se recubrieron en cada pozo. Las placas se calentaron en un termocilcador MJ PTC-200 DNA ENGINE (MJ Research) a 95°C duraníe 5 minuíos después se enfriaron a la íemperaíura de incubación de 63°C. La fluorescencia se leyó después 20 minuíos y 40 minuíos uíilizando al lector del microplaca Safire (Tecan, Zurich, Suiza) utilizando los siguientes ajustes. 495/5 nm de excitación/ancho de banda y 520/5 nm de emisión/ancho de banda para la detección de tinte F; y 600/5 nm de emisión/ancho de banda, 575/5 de excitación/ancho de banda en la posición Z, 5600 µs; número de desíellos, 10; íiempo de reíraso, 0; íiempo de iníegración, 40 µ sec duraníe la defección del tinte R. El incremento se ajustó para el tiníe F en 90 nm y el íiníe R en 120. Los daíos raw son generados por el disposiíivo/insfrumenío usado para medir el rendimiento del ensayo (tiempo real o modo del punto final). De las 192 reacciones, los llamados genotipos pueden hacerse durante 157 después de 20 minutos y 158 después de 40 minutos, o un total de 82%. Para 88 de los ensayos, el genotipo resultaníe esfá disponible para la comparación de los daíos obtenidos previamente utilizando el PCR monoplex seguido mediante el análisis INVADER o los resultados INVADER obtenidos directamente del análisis del ADN genómico. Para 69 resultados, ningún resultado del genotipo corroborado está disponible. Este ejemplo muestra que es posible amplificar más de 150 loci en una sola reacción de PCR multiplexada. Este ejemplo además muestra que la cantidad de cada fragmento amplificado generado en tal reacción de PCR multiplexada es suficiente para producir el llamado genotipo discernable cuando se utiliza como un objetivo en un ensayo INVADER. Además, muchos de los amplicones generados en este ensayo de PCR multiplex dio la señal alta, medida como FOZ, en el ensayo INVADER, mientras algunos dieron tal señal baja que ningún llamado genotipo podrá hacerse. Aún otros amplicones se presentan en tales niveles bajos, o en absoluto, que no pudieron proporcionar ninguna señal en el ensayo INVADER. EJEMPLO 6 OPTIMIZACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DEL CEBADOR PARA MEJORAR EL RENDIMIENTO DE LAS REACCIONES DE PCR ALTAMENTE MULTIPLEXADAS La competición entre las reacciones individuales en PCR multiplex puede agravar inclinación de amplificación y ocasiona una disminución toíal en el factor de amplificación comparado con el PCR uniplex. La dependencia del factor de amplificación en la concentración del cebador puede utilizarse para disminuir la inclinación de PCR. Los niveles variables de la señal producida de los diferentes loci amplificados en la PCR 192-plex del ejemplo anterior, tomado con los resultados del Ejemplo 3 que muestran el efecto de la concentración del cebador en el factor de amplificación, además sugieren que puede ser posible mejorar el porcentaje de reacciones de PCR que generan el suficiente objetivo para uso en el ensayo INVADER modulando las concentraciones del cebador. Por ejemplo, una muestra particular analizada en el Ejemplo 5 proporcionó los resultados de FOZ, después una incubación a 40 minutos en el ensayo INVADER, de 29.54 FAM y 66.98 RED, mientras que otra muestra dio los resultados de FOZ después de 40 minutos de 1.09 y 1.22, respectivameníe, inciíando una determinación que fue una señal ¡nsuficienie para generar una llamado genotipo. La modulación de concentraciones del cebador, baja en el caso de la primera muestra y sube en el caso de la segunda, debe ser posible llevar los factores de amplificación de las dos muestras cercanas al mismo valor. Se concibe que esta clase de modulación puede ser un proceso iterativo, requiriendo más de una modificación para llevar los factores de amplificación suficientemente cercanos entre sí para permitir más o todos los loci en una reacción de PCR muliiplex a amplificarse con eficiencia aproximadameníe equivaleníe. EJEMPLO 7 EJEMPLO MULTIPLEX En principio, la amplificación de PCR puede realizarse en un formaío mulfiplex en el cual el loci múliiple se amplifica en el mismo íubo. En prácíica, sin embargo, esíe méíodo puede dar lugar a los rendimieníos alíameníe variables de producios amplificados individuales debido a la inclinación de PCR. Esíe Ejemplo describe la opíimización de las condiciones de reacción multiplexs para minimizar la inclinación de amplificación. La inclinación de amplificación es causada por la proporción de amplificación variable enfre reacciones individuales que llevan a una diferencia significativa en los rendimientos del producto de PCR durante un número mayor de ciclos. En este Ejemplo, la amplificación objetivo de PCR se analizó a través de el intervalo completo de la reacción y los parámetros que afectaban el rendimiento de PCR se investigados utilizando el ensayo INVADER cuantitativo. De este trabajo, un modelo que describe la dependencia del factor de amplificación objetivo en la concentración del cebador y tiempo de recocido del cebador se desarrollado, que interpreta un mecanismo fundamental de la inclinación de amplificación. Utilizando la PCR 6-plex como un sistema modelo para probar diferentes condiciones que minimizan la inclinación, dos métodos se identificaron. El primer conteo para ajusfar las concenfraciones del cebador balancea los factores de amplificación de diferentes loci. En el segundo método, la concentración del cebador se mantuvo igual para todas las reacciones individuales, pero el primer período de recocido del cebador y el número de ciclos de amplificación se optimizó para minimizar la inclinación de amplificación. Las condiciones de PCR optimizadas se utilizaron para llevar a cabo una amplificación de PCR 192-plex de 8 muestras de ADN genómico y para uso en genotipo utilizando ensayos INVADER. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales. Los productos químicos y amortiguadores fueron de Fisher Scientific a menos que se indique de oíra manera. La enzima nucleasa Cleavase®1 de esfrucíura-específica 5' (Third Wave Technologies) se purificó como se describe (5). La enzima se dialízó y almacenado en 50% de glicerol, 20 mM de Tris HCI, pH 8, 50 mM de KCI, 0.5% de Tween 20, 0.5% de Nonidet P40, 100 µg/mi de BSA. A menos que se indique de otra manera, A, G, C y T se refieren a desoxiribonucleótidos. Preparación del ADN genómico. Las ocho muesfras de ADN genómico G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7 y G8 se prepararon de 10 mi de leucocitos uiilizando un instrumento AutoPure LS (Geníra Sysfems, Minneapolis, MN). El ADN purificado se diluyó a 13.3 ng/µl en amoríiguador Te que confiene 10 mM de Tris HCI pH 8.0, 0.1 mM de EDTA. Síntesis del oligonucleótido. Los oligonucleóíidos usados en el ensayo INVADER con las reacciones de PCR monoplex y 6-plex se siníeíizaron uíilizando un ¡nsirumento PerSeptive Biosysíems y químicos de fosforamidiía esíándares que incluye A, G, C, T, íiníe 6-carboxifluoresceína (FAM) (Glen Research), íiníe Redmond RED™ (RED) (Epoch Biosciences, Redmond, WA), y Eclipse™ Dark Quencher (Z) (Epoch Biosciences). Las sondas y caseíes FRET primarias se purificaron medianfe CLAR de iníercambio iónico utilizando una columna Resource Q (Amersham-Pharmacia Biotech, Newark, NJ), y las sondas invasivas se purificaron medianíe desalinización sobre las columnas NAP-10 (Amersham 17-0854-02). Las sondas primarias usadas en los ensayos de PCR 192-plex se siníeíizaron por Biosearch Technologies uíilizando columnas C16 CPG (Biosearch Technologies, Novaío, CA, BG1-SD14-1), y purificadas uíilizando columnas de SuperPure Plus Purification (Biosearch, SP-2000-96). Las sondas invasivas para los ensayos 192-plex se siníeíizaron y purificaron por Biosearch Technologies uíilizando la purificación de capíura íriíil-on 5'. Los cebadores de PCR se siníeíizaron por Iníegraied DNA Technologies, Chicago, IL. Las conceníraciones de oligonucleóíidos se deíerminan uíilizando la absorción en 260 nm (A26o) y los coeficieníes de exíinción de 15,400, 7,400, 11,500, y 8,700 A260 M"1 para A, C, G y T, respectivamente. Diseño del cebador para la PCR multiplex. Un programa de computadora, software CebadorDesigner (Third Wave Technologies; Madison, Wl, Ver la Figura 8 y la discusión del Primer Design anterior), se ha desarrollado para asistir en diseñar los cebadores para PCR multiplexado y para reducir la probabilidad de la formación del cebador-dímero. Los cebadores de PCR para el formato multiplex se diseñaron con el software CebadorDesigner utilizando los siguientes parámetros en combinación con la discusión de diseño del cebador anterior y en la Figura 8. Para cada uno de los loci a amplificarse, 500 nucleóüdos- se incluyen en cualquier lado de la SNP para un íoíal de 1001 bases por siíio. Para cada siíio, la secuencia de 60-80 nucleóíidos requerida para la unión de las sondas invasivas y primarias se determinó y los cebadores de PCR delantero e inverso candidato se identificaron mediante la "conducción" externa de esta región. Los cebadores candidato se eligieron basados en los siguientes criterios: (1) los cebadores deben tener una A o C en el extremo 3' para evitar la formación del cebador-dímero; (2) Tm de los cebadores fue 60°C (11,12); (3) los cebadores deben estar entre 12 y 30 nucleótidos en longitud; (4) las dos y tres bases terminales 3' de cualquier cebador no deben ser complementarias a las dos y tres bases terminales 3' de cualquier otro cebador de la mezcla de PCR multiplex; (5) ningún cebador debe tener más del 80% de la secuencia similar a la secuencia del brazo 5' dividido de cualquier sonda primaria INVADER. El algoritmo es iniciado por el diseño del primer y segundo cebadores para un sitio aleatoriameníe seleccionado y procede por la iíeración de agregar más cebadores al estanque. Si ninguno de los cebadores puede diseñarse para uno de los loci, el algoritmo inicia con comenzar utilizando un nuevo sitio aleatoriameníe seleccionado. Diseño del ensayo INVADER. Las sondas primaria e invasiva para los ensayos INVADER se diseñaron con el algoritmo INVADERCreator como se describe en algún oíro siíio (Lyamichev, V. and Neri, B. (2003) INVADER assay for SNP genoíyping. Meíhods Mol Biol, 212, 229-40, incorporado en la presente por referencia). Las secuencias sonda para 1-6 ensayos INVADER corresponden a PCRs 1-6, respectivamente. Las secuencias para los 192 ensayos INVADER para los experimentos de PCR 192-plex se diseñaron utilizando el mismo algoritmo. Análisis cuantitativo de PCR con el ensayo INVADER. Las PCRs 1-6 en formato uniplex o 6-plex se realizaron en 50 µl de amortiguador GeneAmp PCR (PE Biosystems, Foster City, CA) que contiene los cebadores a concentración especificada en el texto, 0.2 mM de dNTPs, 1 µl (5U/µl) de polimerasa de ADN Amplitaq (PE Biosystems, N808-0171), 1 µl (l.lµg/µl) de TaqStarf Aníibody (Cloníech, número de caíálogo 5400-2, Palo Alio, CA) y 50 ng de ADN genómico humana o 3.8 µl de amoríiguador Te para el conírol no objeíivo. Para prevenir la evaporación, cada uno de los pozos se cubrió con 15 µl de Chill-ouí (MJ Research, número de catálogo CHO-1411 Las Vegas, NV) y las placas se cubrieron con un sello de hoja (Beckman Coulter, número de cafálogo BK 538619, Fullerton, CA). El número de ciclos y perfil tíempo-íemperafura para cada ciclo se especifica en el íexío. Cada PCR incluyó una etapa desnaturalizante de muestra inicial de 15 minutos a 95°C y una etapa de incubación final de 10 minutos a 99°C. Cada reacción se llevó a cabo por triplicado en una placa de 96-pozos. Los productos de PCR se diluyen en serie 20-veces en la primera etapa seguida por la dilusión subsiguiente 5 veces en el amortiguador Te que contiene 30 µg/ml de tRNA (Boehringer Mannheim, caí. no. BK 538619, Indianapolis, IN) para llevar las conceníraciones del producío deníro del iníervalo dinámico del ensayo INVADER. Las reacciones INVADER con los producios de PCR diluidos se llevaron en 15 µl que coníenían 0.05 µM del oligonucleótido invasivo, 0.5 µM de cada sonda primaria, 0.33 µM de cada cásete FRET, 5.3 ng/µl de enzima Cleavase XI, 12 mM de MOPS (pH 7.5), 15.3 mM de MgCI2, 2.5% de PEG 8000, 0.02% de NP40, 0.02% de Tween 20 recubierto con 15 µl de aceite mineral (Sigma) en una placa de 96-pozos. Los productos de PCR constiíuyeron 7.5 µl de 15 µl de las reacciones. Para los controles no objetivo 7.5 µl de amortiguador Te se utilizaron en vez del producto de PCR. Las reacciones se incubaron a 95°C durante 5 minutos para desnaturalizar el objetivo y después a 63°C durante un período de tiempo de 20 minutos a 3 h. Las reacciones se detuvieron enfriando las placas a temperaíura ambiente, y la señal de fluorescencia se detectó con un lector de placa de fluorescencia Cytofluor 4000 (PE Biosystems) utilizando 485/20 nm de excitación y 530/25 nm de filtros de emisión para el tiníe FAM y 560/20 nm de excitación y 620/40 de filtros de emisión para el tiníe RED. Cada PCR replicada se analiza con el ensayo INVADER correspondieníe por íriplicado, por lo íanto para cada reacción de PCR, nueve puntos de datos se recolectaron. Para determinar la concentración de los productos de PCR, las curvas estándares se obtuvieron para cada uno de los 1-6 ensayos INVADER utilizando concentraciones estándares de los productos de PCR correspondientes. Los estándares de PCR para los 1-6 ensayos se prepararon mediante amplificación de PCR de las muestras de ADN G1, G2, G6 o G8. Los productos amplificados se concentraron mediante precipitación del etanol, se purificaron utilizando la electrofóresis en 8% de gel sin desnaturalización de la poliacrilamida y se cuantificaron uíilizando un kií de cuaníificación Picogreen dsADN (Molecular Probes, Eugene, OR, caíálogo No. P7589). Las reacciones INVADER para las curvas estándares se produjeron con 0 a 100 fM de los estándares de PCR por duplicado en la misma placa de microtiíulación como los producios de PCR analizados. La conceníración de los producios de PCR analizados se deíerminó a partir de la señal de fluorescencia por una regresión lineal utilizando los tres puntos de datos de la curva estándar más cercana al valor de la señal de fluorescencia de las muestras de PCR. La concentración del producto de PCR y la variación se estimaron para cada una de las réplicas de PCR de las medidas del ensayo INVADER por triplicado. La concentración del producto de PCR para las PCRs por triplicado se estimó utilizando los valores promedio para cada una de las réplicas cargadas por la variación del análisis de ensayo INVADER por triplicado. La concentración inicial de las muestras de ADN genómico usada en la PCR se determinó mediante el ensayo INVADER por triplicado utilizando la misma curva estándar. El factor de amplificación F se determinó como la concentración del producto de PCR estimada multiplicada por el factor de dilusión y dividida por la concentración del ADN genómico utilizada para la PCR. La PCR 192-plex se llevó a cabo en una sola replicada bajo las condiciones descritas para PCRs 1-6 durante 17 ciclos con las muestras de ADN G1-G8, cada concentración del cebador de 0.2 µM, tiempo de recocido del cebador de 1.5 minutos, tiempo de extensión del cebador de 2.5 minutos y la etapa de desnaturalización de la muestra inicial de 2.5 minutos a 95°C. Para el control no-objetivo de las PCRs 192-plexs, el amortiguador Te se utilizó en vez del ADN genómico. Las reacciones de PCR 192-plex se diluyeron 30-veces en amortiguador Te que contenía 30 µg/ml de ARNt (Boehringer Mannheim, 109525) y se calentaron a 95°C durante 5 minutos antes de la adición a las reacciones INVADER. Las reacciones INVADER se produjeron como se describe para los 1-6 ensayos a menos que la sonda invasiva sea de 0.07 µM, y cada prueba primaria sea de 0.7 µM. Las señales de fluorescencia FAM y RED se recolectaron después de 15, 30 y 60 minutos o como se especifica en el texto para las muestras de PCR genómicas y los controles de PCR no-objetivo. La señal de fluorescencia neía se determinó sustrayendo la señal no-objetivo de la señal muestra para cada uno de los 192 ensayos INVADER. El siguiente algoritmo se aplicó al análisis mediante el software de genotipo. (1) Los valores se doblan-sobre-cero para las señales FAM (FOZF) y RED (FOZR) se determinaron para cada ensayo INVADER dividiendo la señal muestra por la señal de control no-objetivo. (2) Para cada ensayo INVADER, un valor de proporción H se determinó como (FOZF-1)/(FOZR-1). (3) Una muestra se definió como heterozigosa (HET) si 0.25< H < 4 y FOZF y FOZR > 1.3; una muesíra se definió como FAM homocigosa si H > 4 y FOZF > 1.6; y una muesíra se definió como RED homocigosa si H < 0.25 y FOZR > 1.6 (4). En iodos los oíros casos una muesíra se llamó un "ambiguo". Para invesíigar los parámeíros que afectaban la PCR, un método se desarrolló para utilizar el ensayo INVADER cuantiíaíivo para determinar el factor de amplificación objeíivo F sobre el intervalo completo de la reacción. El factor F se definió como una proporción de concentraciones del producto amplificado y el ADN genómico inicial, medidos con el ensayo INVADER utilizando las curvas estándares obtenidas con las cantidades conocidas de los productos de PCR como se describe en "Materiales y Métodos". Primero, F se analizó como una función del número de ciclos de PCR n. La PCR uniplex 5 se llevaron a cabo con una concentración del cebador c de 0.1 µM utilizando ADN G2, y F se determinó después de n de 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35 (Figura 2). Como se muestra en la Figura 2, los 5 PCR revelan una dependencia lineal de IgF en n para los primeros 25 ciclos con una inclinación de 0.296 ± 0.0016, que demuestra que la amplificación objetivo es exponencial sobre 7 órdenes de magnitud. El factor de amplificación promedio por ciclo de PCR determinado de la inclinación de la dependencia lineal es igual a 1.98 ± 0.007, indicando que la cantidad del objetivo casi se dobla después de cada ciclo. La inserción en la Figura 2 muestra la dependencia de IgF en n para los ciclos 1, 2, 3 y 5 de la PCR 5 bajo las mismas condiciones a menos que una cantidad mayor de ADN G2 se utilice como objetivo. Esta dependencia también puede aproximarse por una función lineal con el IgF contra la inclinación n de 0.283. Después de 25 ciclos, la PCR 5 alcanza una estabilización en F de 2 x 108 que corresponde a una concentración objetivo de 0.06 µM como se determina de la concentración de ADN genómico inicial de 0.28 fM. La estabilización podrá explicarse por una reducción de los cebadores utilizada en la PCR en una concentración de 0.1 µM o por una inhibición de la PCR por su propio producto. Similar a PCR 5, el análisis cuantitativo de PCR 2 muestra una dependencia lineal de IgF en n para los primeros 25 ciclos con una inclinación de 0.295 ± 0.004 y una estabilización en F de 3 x 108 (datos no mostrados). Estos resultados establecen el ensayo INVADER como un método cuantitaíivo para el análisis de amplificación objeíivo de PCR y demuesíran que PCR procede exponencialmeníe sobre 7 órdenes de magniíud o para por lo menos 25 ciclos. Para invesíigar el efecto de c en F como un medio para ajusfar F y de íal modo para reducir la inclinación de amplificación de las PCRs uniplex 1-6 (Henegariu, O., y colaboradores, Bioíechniques, 23, 504-11, 1997) se invesíigó uíilizando el ensayo INVADER cuantitativo. Cada PCR se llevó a cabo durante 20 ciclos con c de 0.01, 0.025, 0.04, 0.05 ó 0.1 µM. El logaritmo de F como una función de c se muesíra para las PCRs 1, 2, 4 y 5 en la Figura 3 A. La Figura 3A muesfra el efecío de la conceníración del cebador c en IgF para la PCR 1 (•), PCR 2(o), PCR 4 («), y PCR 5 (D). La amplificación de PCR se realizó en 50 mi con c de 0.01, 0.025, 0.04, 0.05 ó 0.1 mM y con 50 ng del ADN genómico G2 para las PCRs 1, 4 y 5 o el ADN genómico G6 para la PCR 2. Cada PCR se llevó a cabo duranfe 20 ciclos uíilizando la eíapa de desnaíuralización paírón duranfe 30 s a 95°C, la eíapa de recocido del cebador durante 44 s a 55°C y la etapa de extensión del cebador durante 60 s a 72°C para cada ciclo. El valor de IgF para la PCR 1 con c de 0.01 mM fue demasiado bajo para las medidas confiables. El error estándar se estimó llevan a cabo las PCRs por triplicado y analizando cada replicación mediante el ensayo INVADER cuantifaíivo correspondieníe íambién por íriplicado. Las PCRs 3 y 6 se realizaron muy similarmeníe a los PCRs 5 y 2, respecíivameníe, y no se muesíran para brevedad.

Exisfe una diferencia significaíiva en F eníre las PCRs realizadas bajo las mismas condiciones de reacción. La diferencia es más pronunciada en c baja; sin embargo llega a ser menos significativa en una c alta donde IgF se acerca al valor máximo teórico de lg(220) o 6.0. Como se muestra en la sección anterior, PCR puede considerarse por ser una reacción exponencial en 20 ciclos, y F puede utilizarse para determinar el factor de amplificación z objetivo en un solo ciclo de PCR como F". Como se describe antes previamente, el efecto observado de c en F puede describirse por un modelo que asuma que el recocido del cebador es el índice que limiía la etapa de PCR en una c menor. En este modelo, la unión del cebador P al marcado T se describe por una segunda reacción de orden con la constanfe del índice de asociación ka P + K-^?PT (1) Asumiendo que el cebador esíá en exceso sobre el objeíivo y que el recocido ocurre a íemperaíuras bajas de fusión del cebador para que se pueda ignorar la reacción inversa, la solución para la reacción (1) es [PT] = T0(l-e~k°«°) (2) donde [PT] es la conceníración de los objeíivos cebados, T0 es la conceníración objeíivo después del ciclo de PCR aníerior, y fa es el íiempo de recocido del cebador. Asumiendo que ambos cebadores de PCR tienen el mismo ka. y el tiempo de recocido ta es suficientemeníe largo para compleíar la duplicación de cada molécula objeíivo preparada, z se puede deierminarse como -kacta z (3) y F después de n ciclos se da por De acuerdo a Eq 4, ln(2- ") debe ser una función lineal de c con una inclinación igual a -/ca-fa. La íransformación de los daíos mosírados en la Figura 3A que uíiliza ?(2-F") coníra las coordenadas c demuesíra la dependencia lineal previsía para cada una de las PCRs (Figura 3B) que proporciona un soporte fuerte para el modelo. En la figura 3B, las líneas rectas muestran el ajuste ultimo-cuadrado para cada una de las PCRs. Los puntos de datos para las PCRs 2 y 5 en c de 0.1 mM no se utilizaron debido a un error estándar mayor. La inclinación de ln(2- ") contra c puede utilizarse para determinar una constaníe del 1 aPP índice de asociación evideníe de la efapa de recocido del a cebador que es sobre lodo definida por el cebador con el ka. inferior. app Los valores de -^- para las PCRs 1, 2, 4 y 5 deíerminados a paríir a de la Figura 3B que uíilizan fa de 44 s son 0.34 106, 0.73 106, 0.45 106 y 1.2 106 y 1.2 106 s"1 M"\ respecíivamenie. Esíos valores esíán cerca de los valores de ka de 1.5 106 s"1 M"1 y 2.6 106 s" M"1 obíenidos para los oligonucleóíidos coríos bajo condiciones del amoríiguador similares. Exisíe por lo menos una diferencia triple entre la ka para el más lento (PCR 1) y el más rápido (PCR 5) que sugiere que la cinética de recocido del cebador puede contribuir significativameníe a la inclinación de amplificación. Los resulíados del análisis cuaníiíaíivo de la amplificación de PCR sugieren dos méíodos para la amplificación objeíivo equilibrada en la PCR multiplex: (1) ajuste de c para cada individuo utilizando la dependencia de IgF contra c y (2) incremento de c y ía para acercar la amplificación máxima para todos los objetivos a fijarse en c como sigue de Eq.4. Las concentraciones del cebador ajustado caíu que proporcionan un valor de F esperado de 104 para cada una de las PCRs 1-6 (Tabla 1) se determinaron de los datos mostrados en la Figura 3A. Tabla 1. Logaritmo del factor de amplificación IgF para las PCRs multiplexadas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 b ajo condiciones de las concentraciones del cebador ajustadas. a PCRs multiplexados 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se realizaron en 50 µl con 50 ng de ADN genómico G2 o G6 duraníe 20 ciclos uíilizando la eíapa de desnaíuralizando duraníe 30 s a 95°C, la eíapa de recocido del cebador durante 44 s a 55°C y la etapa de extensión del cebador durante 60 s a 72°C para cada ciclo. b saju se determinó para cada una de las PCRs 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de la Figura 2 para proporcionar el valor de IgF esperado de 4. c IgFaj? e IgFoo?s para las PCRs 1, 3, 4, 5 y las PCRs 2, 6 se determinaron utilizando la señal FAM de los ensayos INVADER cuantitativos y las PCRs 6-plex realizadas con ADNs genómicos de G2 y G6, respectivamente. El error estándar se determinó de las reacciones de PCR por triplicado, cada una analizada por el ensayo INVADER correspondiente también por triplicado. Las PCR 6-plexs 1-6 se realizaron con cualquiera de las concentraciones caju o un c0025 fijo de 0.025 µM para cada una de las PCRs bajo mismas condiciones como en la Figura 3 utilizando como objetivo los ADNs G2 o G6. Como se muestra en la Tabla 1, bajo las condiciones de ca¡u, todos los seis objetivos se amplificaron aproximadamente 104-veces con un IgF promedio a 4.15 ± 0.17 y una diferencia de 2.75-veces en F entre la más rápida (PCR 3) y la más lenta (PCR 1). Bajo las condiciones de c0.o25, la cantidad del producto total amplificado en la PCR multiplex fue similar a la PCR con cajU con un IgF promedio de 3.89 + 0.91, sin embargo esta fue una inclinación de amplificación significativa como se ilustra por una diferencia de 26.3-veces en F entre las PCRs más rápida y más lenta (3 y 1, respectivameníe). Las PCRs 1-6 íambién se realizaron en un formaío uniplex con ca¡u o c0.025 bajo condiciones del formaío 6-plex y demosíraron los valores de F muy similares a los valores correspondienfes de F mostrados en la Tabla 1. Este resultado sugiere que no hay interferencia significativa entre las PCRs individuales en el formato 6-plex. El balance de PCR ajusfando c es un méíodo poderoso que minimiza la inclinación de amplificación; sin embargo uíiliza una dependencia conocida de F en c para cada una de las PCRs o una opíimización iferaíiva de la conceníración del cebador. Un méíodo alfernaíivo es uíilizar un valor c fijo, pero para realizar PCR bajo condiciones que minimizan la inclinación. Ambos, los daíos experimentales (Figura 3) y el análisis teórico (Ecuación 3) sugieren que z debe asimptóíicameníe acercarse a 2 como el valor del íérmino cta incrementado. Por lo tanto, las PCRs multiplexs se realizaron con una c fija de 0.1 µM, la conceníración máxima uíilizada bajo las condiciones mostradas en la Figura 3, o 0.2 µM y la etapa de recocido del cebador de 90 s en vez de 44 s. Las PCR 6-plexs 1-6 se realizaron durante 17 ciclos para proporcionar el valor IgF teóricamente máximo de 5.1 utilizando como un objetivo los ADNs G1, G2, G6, o G8. El análisis cuantiíaíivo de F con los ensayos INVADER 1-6 se llevaron a cabo uíilizando las señales FAM y RED (para los genotipos de los ADNs genómicos ver Tabla S3) y los valores de IgF se muestran en la Tabla 2. Tabla 2. Logaritmo del factor de amplificación IgF para las PCRs multiplexadas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 bajo condiciones de las concentraciones del cebador fijas. a Las PCRs multiplexadas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se realizaron en 50 µl con c de 0.1 ó 0.2 µM, 50 ng del ADN genómico G1, G2, G6 o G8 durante 17 ciclos utilizando la etapa de desnaturalización durante 30 s a 95°C, la etapa de recocido del cebador durante 90 s a 55°C y la etapa de extensión del cebador durante 150 s a 72°C para cada ciclo. El error estándar se determinó de las reacciones de PCR por triplicado para cada una analizada por el ensayo INVADER correspondiente también por triplicado. Reporta el tiníe fluorescente del ensayo INVADER. La diferencia entre el significado de los valores de IgF obtenidos con las señales FAM y RED no fue significativameníe estadístico para ambas condiciones 0.1 y 0.2 µM de PCR con los valores p de prueba t de 0.88 y 0.77, respecíivameníe, sugiriendo que el análisis de F fue independieníe de íipo del ensayo INVADER. El significado de los valores de IgF para PCRs 1-6 en c de 0.2 µM fue 4.55 ± 0.10, 5.03 ± 0.11, 4.96 ± 0.11, 4.80 ± 0.10, 5.42 + 0.18 y 5.15 ± 0.11, respectivamente, o muy cerca del valor esperado de 5.1. No está claro por que el valor IgF de 5.42 para PCR 5 fue estadísíicameníe mayor que el esperado, aunque el ensayo INVADER 5 demosíró un rendimienío relaíivamenfe bajo con íodas las muesíras de ADN genómico comparadas con los otros ensayo que pueden dar lugar a una proporción artificial mayor del producto de PCR y concentraciones de ADN genómico y valores sobrestimados de IgF. La diferencia enfre el significado de los valores IgF obíenido en c de 0.2 y 0.1 µM fue 0.32, 0.13, 0.18 y 0.17 para las PCRs 1, 2, 4 y 6, respectivameníe. Las diferencias fueron esfadísficameníe significaíivas con los valores p de prueba í correspondieníes de < 0.0001, 0.04, 0.01 y 0.02. La diferencia eníre 0.2 y 0.1 µM significa los valores IgF para las PCRs rápidas (3 y 5) fueron 0.07 y 0.08, respecíivamente, con los valores p de prueba t de 0.37 y 0.47 asumiendo ninguna significación estadística. Este ensayo demuestra que el incremento del término cta mejora el rendimiento de las PCRs lentas y no afecta el rendimiento de las PCRs rápidas en la reacción multiplex que se han acercado aparentemente a la estabilización de amplificación. La siguiente parte de este Ejemplo fue el desarrollo de PCR 192-plex, esencialmente doblando el factor multiplex de 100 alcanzado por (Ohnishi, y colaboradores, J Hum Genet, 46, 471-7, 2001), para el genotipo del SNP con el ensayo INVADER. 192 SNPs que representaban los cromosomas 5, 11, 14, 15, 16, 17 y 19 se seleccionados aleatoriameníe y un ensayo INVADER se diseñó para cada una de las SNPs. Duraníe el proceso de selección, ninguna discriminación coníra SNPs en las regiones repeíidoras se llevo a cabo. Por lo íanío algunas de las 192 SNPs son probablemente amplificadas en loci múltiple. Las condiciones de PCR desarrolladas para la amplificación equilibrada se utilizan con una concentración del cebador fijo debido a un tiempo de simplicidad y desarrollo corto. Las muestras de ADN genómico G1-G8 se amplifican con la PCR 192-plex durante 17 ciclos con c fijo de 0.2 µM, el tiempo de recocido del cebador de 1.5 minutos, tiempo de extensión del cebador de 2.5 minuíos, y después analizadas con ensayos 192 INVADER biplex como se describe en "Maíeriales y Métodos". Las señales netas RED y FAM se obtuvieron eliminando la señal de control no-objetivo de la señal muestra. Una forma para identificar genotipos de las señales netas es utilizar el universal llamada criterio para cada uno de los ensayos como se describe en los "Materiales y Métodos". Estos criterios asumen que las muestras homocigosas tienen solamente la señal de uno de los alelos con o sin señal de reactividad cruzada muy pequeña del otro, y que las muestras heterozigosas producen las señales aproximadameníe iguales para ambos alelos. Tales criterios rígidos a menudo pueden conducir a las equívocas llamadas de otra manera ensayos INVADER funcionales. Como una alternaíiva, los genotipos se llamaron trazando las señales netas FAM y RED para todas las ocho muestras de ADN como un diagrama de dispersión para cada uno de los ensayos INVADER y visualmente ideníificando agrupaciones que corresponden a las muesíras homocigosas y heíerozigosas. El análisis en gráfica de dispersión no puede realizarse si sen incluyen muesíras demasiado pequeñas; esfe análisis también contiene un elemento de subjetividad, puesto que este tipo de análisis visual depende del juicio del operador. En este trabajo, se determinó que ocho muestras son suficientes para hacer los visuales llamados para la mayoría de los 192 ensayos INVADER. Los Ejemplos de los análisis en gráfica de dispersión de acierto y falla se muestran en la Figura 4. La Figura 4 muestra gráficas de dispersión de las señales INVADER FAM y RED netas para ocho muestras de ADN genómico. Las señales FAM y RED netas del ensayo INVADER se graficaron para las muestras de ADN G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7 y G8 amplificadas con la PCR 6-plex. A-C, del genotipo correcto con los ensayos 7, 9 y 25 que asigna todas las muestras a las agrupaciones distiníivas ideníificadas como FAM homocigosas (o), RED homocigosas (D) o heíerozigosas (x). D-F, genoíipo predeíerminado. En el ensayo 6 (D), la muesíra más cercana al origen de coordenadas no puede asignarse a cualquiera de las agrupaciones; en el ensayo 47 (E), las muesíras forman íres agrupaciones disfinfivas pero allí no hay ninguna señal de FAM para cualquiera de las muesíras; en el ensayo 54 (F), las muesíras no pueden ser disíinguirse enfre RED homocigosas con alia reactividad cruzada de señal FAM y heterozígosas con índice de RED/FAM sesgado. RFU -unidades de fluorescencia relativas. Los criterios conservadores se utilizados para el análisis visual, excepto un conjunto completo de muestras si apenas una de las muestras no se puede asignar a una agrupación. También, los conjuntos con señales fuertes en ambos canales no se consideran para dar los genotipos exactos, asumiendo que una reactividad cruzada alta del ensayo INVADER o, más probablemente, la amplificación del loci homólogos múltiple de la PCR. Utilizando estos criterios, las llamadas se hicieron de 161 o 84% de los 192 ensayos. Las llamadas hechas utilizando el software de genotipo descrito en los "Materiales y Métodos" de acuerdo con 82.5% de estas llamadas. Los 31 ensayos INVADER fallidos se investigaron para determinar si la falta fue debido a un factor de amplificación de PCR bajo, rendimiento del ensayo INVADER pobre, o amplificación de secuencias altameníe homologas para la PCR. Las secuencias objeíivo de PCR se analizaron ufilizando BLAT para deíerminar si cualquiera de las PCRs individuales amplificadas más de un sitio. Ocho de 31 ensayos fallaron debido a que, para cada uno de ellos, el loci múltiple se amplificado probablemente por la PCR y cada uno del loci se podrá detecíar por el ensayo INVADER. Los 23 ensayos resfaníes se asumieron que fallan debido a una o una combinación de las siguieníes razones: amplificación de PCR pobre, falla en el diseño del oligonucleóíido y fabricación, o secuencias de repetición desconocidas no se incluyen en el montaje del genoma humano de abril 2003. Excluyendo los 8 ensayos que fallaron debido a secuencias de repetición en el genoma, la eficiencia de la PCR 192-plex con el genotipo del ensayo INVADER se estimó como 161/184 o 87.5%. Para estimar el inclinación de amplificación en la PCR 192-plex, la señal de fluorescencia RED neta normalizada por alelo se gráfico para los 161 ensayo INVADER acertados realizados en las ocho muestras de ADN contra la longitud objetivo de PCR como se muestra en la Figura 5. La Figura 5 muestra la señal de fluorescencia RED neta normalizada por alelo para los 161 ensayos INVADER acerfados como una función de longifud objetivo de PCR.

Las reacciones INVADER se produjeron durante 60 minutos con las ocho muestras de ADN cada uno amplificado con la PCR 196-plex. La línea muestra una regresión lineal de la señal neta como una función de longitud objetivo de PCR. Existe una variabilidad significativa en la señal neta que incluye la variabilidad en la amplificación de PCR y rendimiento del ensayo INVADER. Los resultados similares se obtuvieron para la señal FAM neta. Existe una correlación débil entre la señal neta y la longitud objetivo que sugiere que los objetivos de PCR mayores de 700 bp tendrá una probabilidad baja para permitir el genotipo acertado. Sorpresivamente, a pesar de la variabilidad alta en la señal neta, el genotipo se llevó a cabo satisfacíoriameníe en los exfremos superior e inferior de la distribución de señal. Para investigar la robustez observada del genotipo del ensayo INVADER, la señal neta para las mismas 192 reacciones INVADER se midió después de 15, 30 y 60 minutos. Debido a que la amplificación de señal en el ensayo INVADER es cuadrática con el tiempo (1), los 30 y 60 puntos de tiempo mínimos serán equivalentes a la reacción de 15 minutos realizada con el nivel objetivo mayor 4-veces y 16-veces, respectivameníe, así de modelo bajo, intermediario y niveles altos de la amplificación de PCR. Como un ejemplo, las gráficas de dispersión para el ensayo INVADER 110 obtenidas a 15, 30 y 60 min de los puntos de tiempo se muestran en la Figura 6. La Figura 6 muestra las gráficas de dispersión de las señales FAM y RED netas para las ocho muestras de ADN. El ensayo INVADER 110 se llevó a cabo con las muestras de ADN amplificadas con PCR 196-plex y la señal se midió después de 15 (A), 30 (B) y 60 min (C). Las muestras se identificaron como homocigosas FAM (o), homocigosas RED (D) o heterozigosas (x) para el análisis de la gráfica de dispersión. RFU -unidades de fluorescencia relaíivas. Las gráficas de dispersión demuesíran que el genoíipo INVADER medianfe el análisis de agrupación no se efecíúa medianíe una señal neía fueríe y pueden iníerpreíarse incluso duraníe los 60 min de la reacción, donde la señal FAM y RED neta alcanzan la saíuración. Como resulfado de esíe efecío, más llamadas pueden hacerse con reacciones INVADER mayores, debido a que se generan más señales para las PCRs lenías, mejor ideníificación del genotipo, pero al mismo tiempo la señal alta para las PCRs rápidas no afecta los agrupamientos de muestra. EJEMPLO 8 AMPLIFICACIÓN DE PCR Y ANÁLISIS DE ENSAYO INVADER EN UN SOLO RECIPIENTE DE REACCIÓN Este ejemplo describe un método para utilizar PCR para amplificar cantidades pequeñas de un objetivo seguido por un análisis de ensayo INVADER que es un solo recipiente de reacción. En particular, este ejemplo describe conducir estas dos reacciones sin la necesidad de manipulaciones o adiciones de reactivo después de una sola preparación de reacción. A menos que se indique lo contrario, los siguientes ejemplos se lleven a cabo con los reactivos indicados para ensayos para deíecfar secuencias en el gen DLEU (cromosoma 13) y el gen a-actina (cromosoma 1): 10 mM de amoríiguador MOPS, ph 7.5 7.5 mM de MgCI2 dNTPs, 25 µM de cada uno ADN genómico 10 ng cebadores de PCR 200 nM de cada uno Sondas primarias 0.5 µM oligos INVADER 0.05 µM sondas FRET 0.05 µM enzima CLEAVASE (VIII o X) 100 ng ADN polimerasa Taq Síoffel o nativa 1 u cebadores de PCR para DLEU: cebador delantero 1716-14-1 (SEC ID NO: 1): 5'-CCCGACATTTTTACGCATGCGCAAACTCCAACC-3', Tm = 73.8°C Cebador inverso 1716-14-2 (SEC ID NO: 2): 5'-TACACGCACGCGCAAGAAGCAAGAGGACT-3', Tm= 74.1°C Cebadores de PCR para a-actina: Cebador delantero 1716-14-3 (SEC ID NO: 3): 5'-CTGGGTTTCCAACAGGCGAAAAGGCCCT-3', Tm= 73.4°C Cebador inverso 1716-14-4 (SEC ID NO: 4): 5'-GCGTGAGGGTGGAAGGAGATGCCCATGG-3\ Tm= 74.7°C Sondas, oligos INVADER, cásete FRET (bases subrayadas indican las secuencias aleta; bases en negrilla indican la posición 1 en el ensayo INVADER) sonda de a-actina 1734-57 ACGGACGCGGAGAGGAACCCTGTGACAT-hex (SEC ID NO: 5) oligo INVADER de la a-actina 1734-57 CCATCCAGGGAAGAGTGGCCTGTTT (SEC ID NO. 6) sonda DLEU CGCGCCGAGGTTCTGCGCATGTGC-hex (SEC ID NO. 7) Oligo INVADER DLEU AGGGAGAGCCGTGCACCACGATGAC (SEC ID NO. 8) DLEU FAM FRET 23-428 Fam-TCT-Z28- AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG- hex (SEC ID NO: 9) a-actina RED FRET Red-TCT-Z28- TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACTCCGCGTCCGT-hex (SEC ID NO: 10). A. Configuración de reacciones PCR-INVADER combinadas En algunos casos, puede ser deseable separar las reacciones de PCR e INVADER temporalmeníe, por ejemplo llevan a cabo la reacción de PCR bajo condiciones que desfavorezcan la reacción INVADER y después modificando las condiciones de reacción para permiíir que proceda la reacción INVADER. Uno tales medios de crear condiciones de reacción diferenciadas es vía el uso de anticuerpos a las enzimas utilizadas en la reacción, tal como el anticuerpo Light Cycler TaqBlock (Roche Applied Sciences). Oíro íal medio es vía temperatura. En el presente ejemplo, los cebadores de PCR se diseñadas con temperaturas de recocido >70°C mientras los oligonucleótidos de sonda para uso en el ensayo INVADER se diseñaron con Tm de aproximadamente 63°C, tal que las sondas no sean capaces de reaccionar con las moléculas objetivo durante las fases de recocido, exíensión, o desnaíuralización del ciclo de PCR. Además, se deíerminó que mientras el fragmento Stoffel del ADN polimerasa Taq y polimerasa de ADN Taq nativa puede hacer inactivarse por la exposición prolongada a íemperaíura elevada (en de esíe caso, 99°C duranfe 10 minuíos), algunas enzimas CLEAVASE conservan la actividad siguiendo tal tratamiento. En particular, la CLEAVASE VIII parece ser altamente estable a tal calentamienfo y se uíiliza en los subsiguieníes experimeníos. Las reacciones se llevaron a cabo en las cuales iodos los reactivos se combinaron en un volumen final de 10 µl utilizando los componentes descritos antes y recubiertos con aceite mineral. La PCR se permitió proceder durante 11-20 ciclos (95°C durante 30 segundos; 72°C durante 30 segundos a 2 minutos). Después de estas reacciones de ciclación, las mezclas se calentaron a 99°C durante 10 minutos para inactivar la ADN polimerasa Taq. Las mezclas de reacción eníonces se incubaron a 63°C duranfe 30 minuíos a 3 horas para permiíir que las reacciones INVADER procedan. B. Evaluación de la inhibición de la generación de la señal del ensayo INVADER Los resulíados iniciales indicaron que parece ser la inhibición la que limiía la generación de señal del ensayo INVADER. Los siguieníes experimeníos se conducen para evaluar la contribución posible de varios componentes de reacción para esta inhibición. Las reacciones parciales se formularon para examinar los efectos de varios componentes de reacción. Específicamente, varios componentes de reacción INVADER se omitieron de la reacción inicial se prepararon y después agregaron a las reacciones que siguen la inactivación térmica de la ADN polimerasa. En las siguientes tablas, "+" indica que un componente se incluyó en la reacción inicial preparada; "-" indica que un componente se agregó después de la desnaíuralización íérmica de la ADN polimerasa Taq para permifir que procedan las reacciones INVADER. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mops 100'mM 1 ul + + + + + + + + + + + + MMggCCII22 11 uull + + + + + + + + + + + + dNTP 1.25 mM ea 0.2 ul + + + + + + + + + + + + Cebadores 1716-14-1/25 uM ea 0.4 ul + + + + + + + + + + + + Cebadores 1716-14-3/45 uM ea 0.4 ul + + + + + + + + + Stoffel 10 u/ul 0.1 ul + + + + + + + + + gADN 03-422 100 ng/ul 1 ul + + + + + + Dleu/a-actina PPI-FRET 5x (-Dleu Inv) 3 ul + - - + INVADER Dlue 2.5 uM 0.6 uiV + + + + + + Cleavase VIH 100 ng/ul 1 ul + + + + Volumen 10 ul (95C 30"->72C 30") 20->98C 5' Después de PCR se agregaron los componentes faltaníes (-) en 5 ul 10 mM de Mops, 7.5 mM de MgCl2 y produjeron a 95C 3'->63C 3 h.

Ej: 485/20 1478 80 1158 1519 67 1250 61 53 68 68 55 Em: 530/25 Incremento: 45 Ej: 560/20 1977 1233181020395121860707870879857 Em: 620/40 Incremento: 50 La comparación de los resultados en las columnas 2 y 5, en los cuales las mezclas de FRET se incluyen durante la reacción de PCR, están en las columnas 1, 3-4 y 6, en las cuales las sondas de FRET no se agregaron hasta después de que la reacción de PCR se hubiera suspendido, sugiere que la señal generada en el ensayo INVADER es inhibida por la presencia de las mezclas de PPI-FRET.

Los experimentos subsiguientes (ver abajo) en los cuales cada componente de las mezclas de PPI-FRET se omitió durante la reacción de PCR confirman que las sondas del FRET son inhibitorias.

Mops 100 mM 1 ul + + + + + + + + MgCI2 1 ul + + + + + + + + dNTP 1.25 mM ea 0.2 ul + + + + + + + + Cebadores 1716-14-1/25 uM ea 0.4 ul + + + + + + + + Cebadores 1716-14-3/45 uM ea 0.4 ul + + + + + + + + Stoffel 10 u/ul 0.1 ul + + + + + + + + gADN 03-422 100 ng/ul 1 ul + + + + + + + + Prueba Dleu 15 uM 0.5 ul Prueba a-actina 15 uM 0.5 ul Dleu invader 2.5 uM 0.5 ul invader a-actina 2.5 uM 0.5 ul _ . . _ + . _ + Dleu FRET 23-4287.5 uM 0.5 ul . _ _ _ . + - + FRET a-actina 23-7557.5 ul 0.5 ul _ . _ - _ _ + + Volumen 10 ul (95C 30"->72C 30") 20->98C 5' Después de I aPCR se agregaron los componentes faltanfes (-) en 5 ul 10 mM de Mops, 7.5 mM de MgCI2 y acíivaron a 95C 3'->63C 3 h. Ej: 485/20 108 1782 1800 1692 1720 1009489 Em: 530/25 Incremento: 45 Ej: 560/20 236333133053324329502284 1706556 Em: 620/40 Incremento: 50 El examen de las tres columnas más derechas en esta tabla indica que la generación de señal del ensayo INVADER fue reducida para estas reacciones en las cuales cualquier o ambas sondas de FRET están presentes (" + ") de la iniciación de la reacción con relación a aquellas en las cuales se omitieron. Los experimentos adicionales en los cuales la cantidad de polimerasa Taq se incrementó demostraron que un incremento de 2-veces en ADN polimerasa Stoffel da lugar a una generación de señal creciente en el ensayo INVADER. Con base en estos experimentos, se determinó que el incremento del tiempo de extensión durante la reacción de PCR así como la optimización de la concentración de la ADN polimerasa Taq redujo el impacto de esta inhibición.

C. Optimización de las condiciones de reacción del ensayo de PCR e INVADER combinado Los experimentos se llevaron a cabo para optimizar las cantidades de varios componentes de reacción y los tiempos de varias etapas en los ensayos combinados. La concentración de MgCI2 fue variada sobre un intervalo de 1.7 mM a 7.5 mM; las concentraciones de dNTP se probaron durante un intervalo de 25-75 mM; la concentración del cebador fue variada de 0.2 µM - 0.4 µM. Los datos ejemplares obtenidos que utilizan la polimerasa Taq nativa se presentan más adelante e indican que la generación de la señal de FAM es dependiente en la presencia del oligo DLEU INVADER y que ambas reacciones INVADER generan la siguiente señal 17 ciclos de PCR seguido por 10 minutos a 99°C para desnaturalizar la ADN polimerasa Taq nativa seguida por unos 30 minutos de reacción INVADER a 61°C. Mops 100 mM 1,5 ul + + + + MgCI225 mM 1.5 ul + + + + Dleu/a-acíina PPI-FRET 5X (-Dleu Inv) 3 ul + + + + Dleu invader 2.5 uM, 0.05 uM final 0.3ul + + - + Cleavase VIH 100 ng/ul 1 ul + + + - TaqPol (nativo) 5 u/ul 0.2 ul + + + + Cebadores 1716-14-1/25 uMea, 0.4 uM final 1.2 ul + + + + Cebadores 1716-14-3/45 uM ea, final 0.4uM 1.2 ul + + + + dNTP 1,25 mM ea.25 uM final 0.3 ul + + + + gADN 03-422 10 ng/ul 1 ul - + + + UL del volumen 15 (95C 30"->72C 2') 17->99C 10->61C 30' Ej: 485/20 110 1744 115 87 Em: 530/20 Incremenío: 45 Ej: 560/20 123 2642 2700 112 Em: 620/40 Incremenío: 50 D. Respuesta a dosis del ensayo de PCR-INVADER combinado Los experimeníos se llevaron a cabo para moniíorear la generación de señal en el ensayo PCR-INVADER combinado durante un intervalo de concentraciones objetivo del ADN genómico inicial. Las reacciones se establecieron como sigue: 1 6 8 Mops 100 mM 1.5 ul — + + + + + + + + MgCI275 mM 0.75 ul + + + + + + + + Dleu/a-actina PPI-FRET 5X 3 ul + + + + + + + + Cleavase VIH 100 ng/ul 1 ul + + + + + + + + TaqPol (naíivo) 5 u/ul 0.1 ul + + + + + + + + Cebadores 1716-14-1/25 0.6 ul + + + + + + + + uM ea, 0.2 uM finí Cebadores 1716-14-3/45 0.6 ul + + + +- + uM ea, 0.2 uM finí dNTP 1.25 mM ea, 25 uM 0.3 ul +• + + + + final gDNA 5 ng 02948A 1.5 1 0.75 0.5 0.3 0.1 Volumen 15 ul (95C 30"->72C 2') 12->99C 10'-> 60C 60' Las reacciones INVADER se dejaron proceder duraníe 120 minuíos, y los resultados se leyeron después de 60 minutos o 120 minutos. Los resulíados de los 120 minuíos leídos se presenfan en la Figura 7. Esíos resulíados indican que la reacción de PCR-INVADER combinada es lineal sobre un iníervalo de conceníraciones de ADN y es suficieníemente sensible para detecíar hasía el más pequeño como 1.5 ng de ADN genómico humano. E. PCR multiplex combinada con la detección del ensayo INVADER biplex Los experimeníos adicionales se condujeron para analizar las reacciones de PCR multiplex en combinación con el ensayo INVADER. Las reacciones de PCR 20-plex se ajustaron como se describe más adelante. Las mezcla PCR CF contiene cad uno de los cebadores en la tabla más adelante en una concentración de 1 µM. Las muestras de ADN genómico se obtuvieron de Coriell como sigue en la tabla siguiente. vol (ul) 10X vol MgCI2 (50 mM) 2.25 22.5 Cleavase VIH 100 ng/ul 1.00 10.0 Taq pol nativo (5 unidades /ul) 0.10 1.0 Mezcla de dNTP 1.25 mM 0.30 3.0 Mezcla del cebador de PCR (1869-80)(1 uM de cada uno) 3.00 30.0 DNA gDNA 10 ng/ul 1.00 10.0 H20 4.35 43.5 Suma 12.00 120.00 Las muesíras de Coriell se numeraron como sigue (por Ejemplo "C" n) Coriell # Genoíipo 1 NAI 1277 1507 del HET 2 NA11280 711 + 1G>T/621 + 1G>T HET 3 NA01531 delF508 HOM 4 NA04539 delF508 HOM 5 NA07381 delF508/3849+1 Okb HET 6 NA07441 3120 + 1 G>A/621 + 1 G>T HET 7 NA07469 delF508/R553X 8 NA11283 A455E/delF508 HET 9 NA11284 R560T/delF508 HET 10 NA11286 delF508/G551 D HET 11 NA11290 A455E/621+1G>T HET 12 NA07552 delF508/R553X 13 NA08342 delF508/G551 D HET 14 NA11275 3659delC/delF508 HET 15 NA12785 G551D/R347P HET 16 NA11472 G1349D/N1303K HET 17 NA11496 G542X HOM 18 NA11497 G542X HET 19 NA11723 W1282X HET 20 NA11761 G551 D/R553X HET 21 NA11282 G85E/621 + 1 G>T HET 22 NA12960 R334W/mutación desconocida HET 23 NA13032 I506V 24 NA13033 F508C 25 NA13423 G85E/D1152H HET 26 NA11859 2789 + 5G>A HOM 27 NA11860 3849+10kb HOM 28 NA12444 1717-1G>A HET 29 NA12585 R1162X HET 30 NA13591 delF508/R117H HET 31 NA08338 G551D 32 NA11281 621 + 1 G>T/delF508 34 NA12961 V520F 35 NA11278 Q493X/delF508 36 NA11285 Y1092X (C>A)/delF508 38 NA00946 AN1 39 NA00130 AN2 Los cebadores de PCR se seleccionaron de los siguientes. cftr exon 3 TGGTCCCACTTTTTATTCTTTTGCAGA cftr exon 4 AAGTCACCAAAGCAGTACAGCC cftr exon 5 GCTGTCAAGCCGTGTTCTAGATAAA cftr exon 7 CGGAAGGCAGCCTATGTGAGA cftr exon 9 CATGGGCCATGTGCTTTTCAAAC ccffttrr eexxoonn 99--11 CATGGGCCATGTGCTTTTCAAAC fr exon 9-2 TTCTTGGTACTCCTGTCCTGAAAGA ir exon 10 ATTATGGGAGAACTGGAGCCTTCA ir exon 11 GATTACATTAGAAGGAAGATGTGCCTTTCAA tr exon 12 TAAGGCAAATCATCTACACTAGATGACCA tr exon 13 TAACTGAGACCTTACACCGTTTCTCA tr exon 14B ATGGGAGGAATAGGTGAAGATGTTAGAA tr exon 16 TCTGAATGCGTCTACTGTGATCCA tr exon 17A CCTGCACAATGTGCACATGTACC tr exon 17B GGACTATGGACACTTCGTGCC tr exon 18 GGAGAAGGAAGAGTTGGTATTATCCTGAC tr exon 19 GCATCAAACTAATTGTGAAATTGTCTGCC tr exon 19-1 GCATCAAACTAATTGTGAAATTGTCTGCC tr exon 1 9-2 GAAGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACA ir exon 20 GTACCTATATGTCACAGAAGTGATCCCA tr exon 21 GATTAGAAAAATGTTCACAAGGGACTCCA tr 3849+ 1 Okb CAGTTGACTTGTCATCTTGATTTCTGGA tr exon 1 7A-2 CCTCGACAATGTGCACATGTACC cebador i nverso tr exon 3 ACCTATTCACCAGATTTCGTAGTCTTTTCA tr exon 4 TGTACCAGCTCACTACCTAATTTATGACA tr exon 5 GAGCTGAGCAAGACTTAACCACTAATTAC fr exon 7 GTGAACATTCCTAGTATTAGCTGGCAAC tr exon 9 CTCCAAAAATACCTTCCAGCACTACAAA fr exon 9-1 GAAATTACTGAAGAAGAGGCTGTCATCAC tr exon 9-2 CTCCAAAAATACCTTCCAGCACTACAAA cftr exon 10 GACTAACCGATTGAATATGGAGCCAAA cftr exon 11 CTTAAATGTGATTCTTAACCCACTAGCCA cftr exon 12 GAGGTAAAATGCAATCTATG ATGGGACA cftr exon 13 TAAGGGAGTCTTTTGCACAATGGAAAA cftr exon 14B ACCTCACCCAACTAATGGTCATCA cftr exon 16 TAGACAGGACTTCAACCCTCAATCA cftr exon 17A GAGTATCGCACATTCACTGTCATACC cftr exon 17B AAGGTAACAGCAATGAAGAAGATGACAAA cftr exon 18 TAATGACAGATACACAGTGACCCTCAA ccffttrr eexxoonn 1199 GCTTCAGGCTACTGGGATTCAC cftr exon 19-1 GTCATCTTTCTTCACGTGTGAATTCTCAA cftr exon 19-2 GCTTCAGGCTACTGGGATTCAC cftr exon 20 TTCTGGCTAAGTCCTTTTGCTCAC cftr exon 21 CATTTCAGTTAGCAGCCTTACCTCA cftr 3849 + 1 Okb TCCTCCCTGAGAATGTTGGATCAA Vs1 Int síd F TGATG GTG GTATGTTTTCAG G CTAGA Vs1 Int std R GTTCTCCCCTGTCCCAGTTTTAAC Las reacciones de PCR se produjeron como se describe antes con una extensión de 2.5 min a 72°C y una desnaturalización sec 45 a 95°C durante 14 ciclos. Las mezclas se calentaron a 99°C durante 10 minutos y después se enfriaron a 63°C durante 1 hora. Los resultados se presentan en la Figura 9A-B. La muestra delF508 fueron de Coriell # 3; el G85E/621 +1 G>T fue de Coriell 21; 1717-1g>A, Coriell 28; delF508/R117H fue de Coriell 30; delF508/3849 + 10kb, Coriell 5; A455E/delF508, Coriell 8, y R560T/delF508 Coriell 9.

Estos resultados indican que el ensayo INVADER más combinado de PCR puede producirse con reacciones PCR multiplex. EJEMPLO 9 ENSAYO INVADER TETRAPLEX: SISTEMA 4-TINTE Un medio adicional para incrementar la producción total del análisis es incrementar el número de reacciones INVADER que pueden producirse y analizarse en una sola reacción o recipiente de reacción. El presente Ejemplo describe la implementación de ensayo INVADER 4-plex en el cual cuatro conjuntos de oligonucleótidos se incluyen en una sola reacción. En este caso, la reacción también incluye cuatro secuencias objetivo distintas: versiones tipo silvestre y variables de dos diferentes SNPs. Las configuraciones alternativas también se contemplan, incluyendo cuatro loci distintos, tres loci distiníos y un conírol interno, etc. Una variable en configuración del ensayo INVADER para el análisis de FRET multiplex se relaciona con la elección de los tiníes para la inclusión en las pruebas de FRET. Las numerosas combinaciones de íintes y retardadores se conocen en la técnica (ver, por Ejemplo, Pateníes Noríeamericanas Nos. 5,925,517, 5,691,146 y 6,103,476, cada una incorporada en la preseníe por referencia). En algunas modalidades, es deseable seleccionar las combinaciones del retardador de íinte que exhiban interferencia mínima con la actividad de división de la enzima CLEAVASE. Tales combinaciones del retardador de tinte cuando se utilizan con el ensayo INVADER pueden favorecer un índice de productividad más ópíimo. Otra consideración que afecta la elección de tintes se relaciona con sus caracterísíicas especírales. En algunas modalidades, por ejemplo, para los ensayos deíecíados en un lecíor de placa de fluorescencia, se prefiere que las señales fluoresceníes de cada íiníe sean especíralmeníe resolubles entre sí por el instrumenio. Si no son disíinías lo suficieníemente espectrales, la salida de' la fluorescencia de un tiníe podría interferir o "sobre imprimir" en la señal atribuida a otro tiníe. Esía "conversación cruzada" puede conducir a la sensibilidad del ensayo disminuida o índice de error creciente. Algunos instrumeníos fienen capacidad susíancial para resolver la defección de la señal que se deíecía en canales múlíiples (por ejemplo, a íravés del uso de filtración óptica y/o manipulación del software de la señal recolectada), así la selección de varias combinaciones de tiníes se relaciona con el insírumenío a uíilizarse para deíecíar la reacción mulíiplexada. La salida de fluorescencia de un tinte dado desde una escaneada del lector de placa de fluorescencia es proporcional a su concentración como sigue: Fluorescencia = a • [tiníe] + b (1) Donde a es una constante que varía con las longitudes de onda de excitación y emisión y los ajustes de incremento del lector de placa y b es el antecedente. Si los tintes múltiples están presentes, entonces cada tinfe coníribuye a la fluorescencia íoíal como Fluorescencia = a • [tiníea] + ß • [tinte ] + Y • [ííníec] +... n • [íinten] + antecedeníe (2) o Fluorescencia — aníecedeníe = a • [íiníea] + ß • [tinteb] + Y • [tintec] + ... n • [tinten] (3) Cuando se hacen las exploraciones m últiples, la fl uorescencia de cada escaneado puede escribirse tal como: Fluorescencia! — antecedentei = a-¡ • [tinfea] + ß^ • [tiníeb] + Y? • [tiníec] +... n1 • [íiníen] Fl uorescencia2 — antecedenfe2 = a2 • [íinfea] + ß2 • [íinieb] + ?2 • [tiníec] + ... n2 • [tinten] Fl uorescen cia3 — aníecedeníe3 = a3 • [íintea] + ß3 • [tiníeb] + ?3 • [tintec] + ... n3 • [tinten] Fluorescencian — antecedeníen = an • [tiníea] + ßn • [íinteb] + ?n • [tiníec] +... nn • [tintep] donde los subíndices numéricos representan las lecturas de fluorescencia , coeficientes de tinte, y com ponente antecedentes para cada escaneado. Estas series de ecuaciones l ineales puede escribirse en forma de m atriz como F=Ad (4) donde los elementos de la matriz lineal F son las lecturas de fluorescencia eliminadas antecedeníes, A es la maíriz del coeficieníe bidimensional, y d es la maíriz lineal cuyos elemeníos son las caníidades de cada íinte libre suminisfrado del ensayo INVADER. Los elemenfos de las maírices F y A pueden deíerminarse proporcionando que hay una ciería clase de calibración que utilizan íintes puros y espacios en cada escaneado diferente. Por lo tanío, la solución para d puede enconírarse por la izquierda que mulíiplica ambos lados de la ecuación (4) por el contrario de A. Tal matriz se derivó para el tinte 4-plex establecido como sigue. Los oligonucleótidos de tinte T10, es decir oligos que comprenden 10 residuos dT con un tiníe 5' íerminal, se uíilizaron para deíerminar caracíerísíicas de emisión de "tiníe libre".

Diferentes cantidades de estos oligos dT10 se combinaron con sondas FRET que comprenden el tinfe correspondieníe y un enfriador apropiado para la generación de una señal mímica a paríir del ensayo INVADER duraníe un periodo. La reserva de trabajo de 500 nM se hizo de cada dT10 y de cada sonda FRET, respectivamente. Los volúmenes de muestra totales fueron de 15 µl, y cada muestra se recubrió con 15 µl de aceite mineral. Las cantidades probadas fueron de 0% dT10/100% sonda FRET; 25% dT10/75% sonda FRET; 50% dT10/50% sonda FRET; 75% dT10/25% sonda FRET; y 100% dT10/0% sonda FRET. Los tiníes probados fueron fluorescein (FAM), Cal-Gold y Cal-Orange (Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA), y REDMOND RED (Synthetic Genetics). Los tubos se leyeron en Tecan Safire XFLUOR 4 a longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas para cada tinte. En cada caso, la fluorescencia observada de cada tinte incrementó linealmente con proporciones aumentadas de oligo dT10, y las señales fueron aditivas. Las inclinaciones de las regresiones lineales se incorporaron en la matriz de coeficiente como sigue.

Una matriz correspondiente fue generada tomando lo inverso de cada valor para obtener A"1, según lo descrito anteriormenfe y así derivar d, el porceníaje de íiníe libre en cada caso. Los ensayos INVADER se activaron como sigue. Las reacciones estándares se ajustaron a un volumen final de 15 µl según lo descrito anteriormeníe con la enzima CLEAVASE VIII y 5 pM de objeíivo siníético (final). Cuatro objetivos sintéticos diferentes se utilizaron en el presente ejemplo: tipo silvestre y muíante para SNPs 1 y 2. Las sondas FRET usadas fueron como sigue: Los ensayos se incubaron a 63°C y la fluorescencia se leyó a las longitudes de onda indicadas después de 20 minutos. Los resultados para estas reacciones combinadas se presentan en la Figura 10, que muestra la detección de varias combinaciones de moléculas objetivo. EJEMPLO 10 TARJETA MICROFLUIDICA PRE-CARGADA CON REACTIVOS DE ENSAYO INVADER PARA DETECCIÓN DE OBJETIVO El siguiente ejemplo describe el uso de una tarjeta microfluídica que contiene los reactivos del ensayo INVADER para el examen de las muestras de ADN. En este ejemplo, el material objetivo se ha preparado por preparado por separado mediante PCR. La tarjeta microfluídica de 3M tiene 8 puertos de carga, cada uno de los cuales se configura para suministrar el reactivo líquido a 48 cámaras de reacción individuales duraníe la centrifugación de la tarjeía. Las cámaras de reacción contienen componentes de reacción del ensayo INVADER pre-distribuidos y secados para la detección de uno o más alelos particulares (por ejemplo según lo mostrado en el ejemplo 11, posterior). Se disuelven estos reactivos cuando entran en contacío con los reactivos líquidos durante la centrifugación de la tarjeta. Las mezclas de reacción de PCR múltiplex se prepararon usando los siguientes componentes (las concentraciones mostradas están a su conceníración final en la reacción de PCR): el ADN genómico en 2 ng/ul, mezcla de cebador de PCR múltiplex en 0.2 uM, amortiguador de PCR más MgCl2 en 1X, dNTPs en 0.2 mM, y polimerasa Taq nativa en 0.2 U/rxn. El volumen de reacción final fue de 20 ul. Estas mezclas se calentaron durante 2.5 minuíos a 95°C, después se cicló 20 veces a través de una etapa de 30 seg a 95°C, etapa de 1.5 minutos a 55°C, y una etapa de 2.5 minutos a 72°C. Finalmente, las muestras se incubaron a 99°C durante 10 minutos para eliminar la actividad de la polimerasa. Después de la PCR, los amplicones se diluyeron 1:125 con dH20 y 50 uL de esta muesíra se mezclaron con 50 µl de una solución que coníiene 28 mM de MgCI2 y enzima CLEAVASE X a 4 ng/µl. Esía mezcla entonces se agregó a uno de los 8 puertos individuales de la tarjeta microfluídica CF de 3M descrita en el ejemplo anterior. El ensayo INVADER se llevó a cabo a 63°C durante 20 minutos, y la fluorescencia del ensayo se detectó en un fluorímetro de microplacas. Los resultados se muestran en las Figuras 11A-11G. El genotipo del ADN genómico de la muestra se indica en la parte superior de cada panel, y cada una de las mutaciones probadas se indica a lo largo del eje x. EJEMPLO 11 INVADER MAS PCR EN LA TARJETA MICROFLUÍDICA CF DE 3M El siguiente ejemplo describió el uso de la tarjeta microfluídica que contiene los reactivos del ensayo INVADER para el examen de las muestras de ADN. En este ejemplo, el material objeíivo se amplifica y detecta en una sola reacción. Las reacciones se produjeron en una tarjeta microfluídica de 3M, según lo descrito anteriormeníe. Las cámaras de reacción de la tarjeta microfluídica contienen los componentes de reacción del ensayo INVADER (es decir, los módulos de oligonucleótidos INVADER, sonda primaria, y FRET) para ejecutar los 48 diferentes ensayos INVADER secos sobre la íarjeía. Para preparar tales tarjeías, se disperso 2µl de de mezcla de 1X PPIFF-MOPS (0.25 µM de cada oligonucleótido de sonda primaria, 0.125 µM de cada oligonucleótido FRET, 0.025 µM de oligonucleótido INVADER, en 10 mM de amortiguador MOP) en los pozos de la tarjeta microfluídica. Las tarjetas entonces se dejan secar en una caja del aire a través de la cual se fuerza el aire filtrado de HEPA. Generalmente no es necesario controlar la temperaíura o humedad relaíiva del aire. El volumen de cada cámara de reacción en la íarjeía microfiuídica montada es de aproximadamente 1.7 ul, así las concentraciones finales de estos componentes durante la reacción son de aproximadamente 1.18 veces los de la mezcla de 1X PPIFF-MOPS). Las varianfes alélicas defecíadas por esíos conjuntos del oligonucleótido del ensayo INVADER, fueron como sigue: Una mezcla principal que coníiene iodos los maíeriales necesarios para una PCR múlíiplex que amplifica los objetivos del ensayo INVADER, junto con la enzima CLEAVASE VIII requerida para el ensayo INVADER, se preparó y dividió en 8 estanques. A 7 de estos 8 estanques se agregó una muestra única de ADN genómico, y la muestra restante se utilizó como un control que no contiene ningún patrón. Se agregó 100 ul de cada una de estas 8 mezclas a cada puerto de carga en la tarjeta, y los pozos en la tarjeta se cargaron por centrifugación. La concentración final de componentes en estas mezclas fue como sigue: 7.5 mM de MgCI2, 6.67 ng/ul de Cleavase VIII, 033 U/uI de Taq-pol nativo, 25 uM de mezcla de dNTP, 0.2 uM de cebadores de PCR múltiplex. Las reacciones de PCR combinada y del ensayo INVADER se incubaron como sigue: 95°C duranfe 15 seg y 72°C durante 2 minutos y 15 seg, durante 15 ciclos, seguidos por un sola etapa de 99°C duranfe 10 minuíos para eliminar la actividad de Taq-pol nativo, seguida por 60°C durante 1 hora para la reacción del ensayo INVADER. La señal fluorescente del ensayo INVADER se detectó en un lector microplacas fluorescentes, y los resultados se presentan en las figuras 12A-12G (se omiten las muestras de control sin objetivo). El genotipo de cada ADN genómico de muestra se indica en la parte superior de cada panel, y cada una de las mutaciones probadas se indica a lo largo de eje X. EJEMPLO 12 DETECCIÓN DIRECTA EN MUESTRAS DE SANGRE ENTERA SIN PURIFICAR Este ejemplo describe el logro de la detección directa de una secuencia objetivo en una muestra de sangre entera sin purificar. En particular, este ejemplo, similar a los ejemplos anteriores, describe la combinación de la amplificación de PCR y de la detección del ensayo INVADER en un solo recipiente de reacción para detecíar un ADN genómico. Este ejemplo, sin embargo, además futuro amplía los ejemplos anteriores aplicando el método de un solo recipiente de reacción, ensayo combinado de PCR-INVADER, a una muestra de sangre entera sin purificar. La mezcla de reacción del ensayo PCR/INVADER, en un volumen total de 20 ul está preparada como sigue. Para el amortiguador, se utilizan aproximadamente 4 ul de 0.5X AMPDIRECT-A de Shimadzu (sin 5X Amp Adición-1) o 10 mM de amortiguador biológico TAPS (3- [[tris(hidroximefiI)metil]amino]ácido propansulfonico) con aproximadamente un pH 9. Se observa que fue inesperado encontrar que TAPS con pH 9, en lugar de solo AMPDIRECT-A, sirviera como amortiguador para la detección directa de PCR y INVADER en sangre entera. También, se pueden encontrar los detalles adicionales en el amortiguador de AMPDIRECT-A y PCR en sangre eníera, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente Norteamericanas 20020102660 y 20020142402, así como Nishimura y col., Clin. Lab., 2002, 48:377-84, y Nishimura y col., Ann. Clin Biochem, 2000, 37:674-80, los cuales se incorporan en la presente por referencia para todos los propósitos). Se utilizan los siguientes reactivos adicionales: 6.25 uM de dNTPs de cada dNTP, 0.2 uM de cada cebador de PCR, 0.3 unidades de polimerasa Taq (nativa), 40 ng de CLEAVASE VIII, 3 mM de MgCI2 (además de cualquier MgCI2 en el amortiguador de AMPDIRECT, si se utiliza éste amoríiguador), 0.5 uM de sonda primaria para que cada objetivo que se detecíara (por ejemplo, para ADN genómico objeíivo y para el conírol interno), 0.05 uM de oligonucleótido INVADER para cada alelo que se deíectara (para el uso con sondas primarias múltiples, si SNP se detectara) o 0.05 uM de oligonucleótido INVADER para que cada objetivo que se detecíara (para el uso, por ejemplo, al cuaníificar un objetivo variable contra una objetivo del control interna), 0.25 uM de cada sonda FRET (para las reacciones objetivo y de control), y agua destilada para un volumen de reacción íofal de 20 ul. La muesíra sangre eníera humana líquida que se probara se trata primero con un anticoagulante, tal como ciírafo de sodio, EDTA de dipofasio, o heparinaío de sodio. Aproximadamente 0.4 ul (o menos) de ésta sangre entera humana tratada son se agregan a la mezcla de reacción de PCR/INVADER cargándola al fondo del tubo de reacción sin mezclarse. Si se necesita el aceite mineral puede ser el recubrimiento. Después, la PCR se realiza en la muestra durante un total de 28 ciclos. La PCR se puede realizar, por ejemplo, usando el siguiente perfil de temperatura, que es adecuado para la sangre entera humana: precalentamiento a 80°C duraníe 15 minutos, después 94°C duraníe 4.5 minutos, seguido por 28 ciclos a 94°C durante 30 segundos, temperatura de atemperado durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuío, y 72°C duraníe 7 minuíos. Después de esías reacciones de ciclo, la mezcla se calienía a 99°C duranfe 10 minutos para inactivar la polimerasa de ADN Taq. La mezcla de reacción enfonces se incuba a 63°C duraníe 30 minutos a aproximadamente 3 horas para permitir que procedan las reacciones del ensayo INVADER. Los resultados del ensayo INVADER se recolectan (ver, por ejemplo, los ejemplos descritos anteriormenfe). Los resulíados de esíe ejemplo muesíran la amplificación acertada de PCR de una secuencia objetivo en ADN genómico dentro de la sangre entera, así como también la detección acertada del ensayo INVADER de la secuencia objetivo de interés. El éxito en la detección de ácidos nucleicos objetivo de interés a partir de ésta sangre entera es posible si se usa AMPDIRECT o TAPS pH 9 como el amorliguador. La defección de ADN direcía con los ensayos combinados de PCR e INVDADER íambién se puede realizar usando íarjeías de punto sangre, tal como las de WHATMAN. El amortiguador de reacción de PCR-INVADER, similar al anterior, se puede preparar como sigue: 10 mM de amortiguador de TAPS pH 9, 3 mM de MgCI2, 0.2 uM de cada cebador de PCR, 6.25 uM de cada dNTP, 0.5 uM de sonda primaria de para cada objetivo que se detecíara (por ejemplo, para el ADN genómico objeíivo y para el conírol inferno), 0.05 uM de oligonucleótido INVADER para cada alelo que se detectara (para el uso con las sondas primarias múltiples, si se detecíara un SNP) ó 0.05 uM de oligonucleótido INVADER para cada objetivo que se deíectara (para el uso, por ejemplo, al cuaníificar un objetivo variable contra un objetivo de control interno) 0.25 uM de cada sonda FRET (para las reacciones de objetivo y confrol), 0.06 ul de TaqPol (nafivo, 5 u/ul), 0.2 ul de CLEAVASE VIII 200 ng/ul, y agua destilada para un volumen final de 20 ul. De una tarjeta WHATMAN FTA Gene manchada con sangre, se toma una punzada de 1 milímetro que contiene la sangre, y se toma una punzada de control del mismo diámetro de una ubicación en la tarjeta sin sangre. Las punciones de papel entonces se lavan en 1 mi de agua durante aproximadamente 10 minutos, con oscilación ocasional para agiíarse. Los ensayos de PCR e INVADER se llevan a cabo como se describió aníeriormeníe. Los resultados de este procedimienío muesfran la amplificación acertada de PCR de la secuencia objetivo de ADN genómico dentro de la sangre entera, así como la detección acertada del ensayo INVADER de la secuencia objetivo de interés. EJEMPLO 13 REACCIÓN DE UNA SOLA ETAPA QUE COMPRENDE LA TRANSCRIPCIÓN INVERSA, REACCIÓN DE LA CADENA DE POLIMERASA Y REACCIONES DEL ENSAYO DE DIVISIÓN INVASIVO EN UN SOLO TUBO DE REACCIÓN Se proporciona posteriormente la detección del ácido nucleico (por ejemplo, ARN) de interés (por ejemplo, para detecíar los niveles de expresión de un gene de inferes o para determinar la presencia de ácido nucleico patogénico) realizando las etapas de síntesis de ADNc mediante la transcripción inversa (RT), amplificación por PCR, y detección por un ensayo INVADER en una sola reacción en un solo tubo sin la intervención de etapas de purificación o adición.

Los intentos iniciales de realizar la RT, PCR, y un ensayo INVADER en un solo tubo se cumplieron con dificultad. Para determinar las condiciones bajo las cuales trabajaría la reacción de una sola etapa, se probaron las condiciones de reacción múlíiple (ver, por ejemplo, la íabla 3).

Se modificaron las conceníraciones finales de sal de KCI, enzima CLEAVASE, y sal de MgCI2 en el amoríiguador mieníras que se maníuvieron consíaníes la caníidad de paírón de ARN y oíros componeníes de reacción. Los componenfes de reacción que se maníuvieron constantes fueron: 10 mM de amortiguador MOPS, 25 uM de dNTPs, 0.5 uM de oligonucleótido de sonda, 0.05 uM de oligonucleótido INVADER, 0.25 uM de oligonucleótido FRET, 0.4 uM de oligonucleótidos de cebador de RT/PCR, 0.5 unidades/rxn de enzima AMV RT, y 0.5 unidades/rxn de enzima Taq DNA polimerasa. También, las condiciones de reacción de ciclación de temperatura se mantuvieron constantes a 48°C durante 45 minutos; 95°C durante 5 minuíos; 20 ciclos repiíidos de las dos etapas de 95°C durante 45 seg, 72°C durante 2 minuíos; 99°C durante 10 minutos, y 63°C duranfe 90 minutos. Como se puede observar posteriormente (ver, por ejemplo, la tabla 3), las mejores condiciones de reacción parecen ser 0 mM de KCI, 100 ng de enzima CLEAVASE, y 7.5 mM de MgCI2. Además, manteniendo constantes todas las condiciones de reacción y solamente sustiíuyendo las enzimas de RT, se deíerminó que la enzima de transcriplasa inversa derivada de MMLV, se proporciona las condiciones de reacción que son un poco más eficientes y sensibles que la transcripíasa inversa derivada de AMV (que generó señales antecedenfes superiores).

Así, después de numerosos iníeníos, la reacción de una sola etapa proporcionó la señal detectable, con varias condiciones de la reacción que se determinaron que son importaníes para que la reacción trabaje efectivamente (ver, por ejemplo, la tabla 3). En particular, se determino que la composición de amortiguador y la identidad de la enzima RT desempeñan una función en la eficiencia y sensibilidad de la reacción de una sola etapa (aunque las condiciones alternativas utilizadas se pueden utilizar si se desea o necesita menos eficiencia o sensibilidad).

Tabla 3. Optimización de las Condiciones de Reacción de Una Sola Etapa. KCl 10mM OfflM 10 mM OmM 10mM omM 10p?M OmM 10mM OmM 10mM OmM Cfeavase 100ng 100 ng 200 pg -200 r¡g 100 ng 100 ng 200 pg 200 ng 100 pg 100 ng 200 ng 200 ng MgCI2 ZStt ? 2.5 mM 2,5 mM 2,5 M 5mM S lM SmtA 5mM 7.5 mM 7.5 mM 7.5 mM 7.5 mM "+ARN" 85 86 102 79 432 654 390 671 27 702 272 08 "+ARN" 87 77 101 76 417 546 395 611 383 633 234 365 "+ARN" 79 75 99 75 389 489 400 418 362 625 520 452 Promedio 83.7 79.3 100.7 76.7 412.7 563.0 395.0 533.3 394,0 533.3 365.0 408.3 Neto 1S.0 11.7 27.0 1.7 346,3 492.0 318,3 450.0 320.0 S9Ü.3 284,0 319.7 FOZ 1.3 1.2 1.4 1,0 6.2 7.9 02. 6.4 5,3 9.1 4.5 4.8 "-ARN" es 67 75 7$ 65 70 75 82 75 73 81 87 "-ARN" 55 64 71 73 65 70 77 S3 72 72 81 87 "-ARN" 67 72 75 76 88 73 78 85 75 74 81 S2 Promedio 65.7 67.7 73.7 75.0 65.3 71.0 76.7 83.3 74.0 73.0 81.0 88,7 Una vez que los intentos de realizar RT, PCR y un ensayo INVADER en un solo tubo fueron exitosos, se realizó una optimización adicional usando ARN viral purificado como ácido nucleico objetivo. El ARN objetivo se mezcló con los siguientes componentes de ensayo y se ensayó a un volumen final de reacción de 15 ul: 75 unidades/rxn de enzima de transcriptasa inversa de MMLV, 0.5 unidades/rxn de enzima Taq DNA polimerasa, 100 ng/rxn de enzima CLEAVASE VIII, 7.5 mM de MgCI2, 10 mM de amortiguador MOPS, 0.667 µM de oligonucleótido de sonda, 0.067 µM de oligonucleótido INVADER, 1 µM de cebador delantero, 1 µM de cebador inverso, 0.333 µM de sonda FRET, y 25 µM de dNTPs. El ensayo se realizó bajo las siguieníes condiciones: 42°C durante 1 hora; 95°C durante 5 minutos; 28 ciclos repetidos de las tres etapas de 95°C durante 30 seg, 60°C durante 30 seg, 72°C durante 2 minutos; 99°C durante 10 minutos, y 63°C durante 1 hora. Una reacción de una sola etapa sin ARN objetivo agregado, se incluyó como un control (ver, por ejemplo, la Tabla 4, NTC) . Se mostró la detección de ARN objetivo (ver, por ejemplo, la Tabla 4, FOZ-veces sobre cero) . Así, la reacción de u na sola etapa de la présenle invención q ue comprende la íranscripción inversa, PC R, y la detección por el ensayo I NVADER realizado en u n solo tubo sin la intervención de eíapas de purificación o adición , proporciona u n méíodo eficieníe y sensible (por ejemplo, solo u na copia de ARN viral proporcionó > la señal 3 FOZ, Tabla 2) para deíecíar el ARN objelivo en una muesíra. Tabla 4. RT/PCR/I NVADER™ EN U N SOLO TU BO copias de ARN viral objetivo/rxn Prom. Neto FOZ 5T 1027 1048 1076 1030 833 4.83 17 1065 1116 1113 1098 8S0 5.04 6 1059 1089 1049 1086 848 4.90 1.9 92S 917 641 829 611 3.81 0.6 714 898 693 76S 551 3.53 0.2 212 213 754 213 -5 0.98 0.1 230 252 211 231 13 1.06 NTC ARNt 222 221 210 218 EJ EMPLO 14 OLIGONUCLEOTIDO MULTIPROPOSITOS U n oligonucleóíido mulíipropósifos se configu ró para actuar como cebador para la síntesis de ADNc durante la transcripción inversa, como cebador 3' ("inverso") durante la amplificación de PCR, y como el oligonucleótido INVADER para el uso en la reacción de división del ensayo I NVADER. Según lo descrito en el ejemplo 13, las etapas de RT, PCR, y la detección por el ensayo de I NVADER se pueden realizar en u n solo tubo .

El ARN viral purificado se utilizó como el ácido nucleico objetivo. El ARN objetivo se mezcló con los siguientes componentes de ensayo y se ensayó en un volumen final de reacción de 15 ul: 75 unidades/rxn de enzima de transcriptasa inversa de MMLV, 0.5 unidades/rxn de enzima Taq ADN polimerasa, 100 ng/rxn de enzima CLEAVASE VIII, 7.5 mM de MgCI2, 10 mM de amortiguador MOPS, 0.667 µM de oligonucleótido de sonda, 1 µM de cebador delantero, 1 µM de los cebador inverso/oligonucleótido INVADER, 0.333 µM de sonda FRET, y 25 µM de dNTPs. El ensayo se realizó bajo las condiciones siguieníes: 42°C duraníe 1 hora; 95°C durante 5 minutos; 28 ciclos repetidos de las tres etapas de 95°C durante 30 seg, 60°C durante 30 seg, 72°C durante 2 minutos; 99°C durante 10 minutos, y 63°C duraníe 1 hora. Como un conírol, se incluyó una muesfra sin ARN objetivo (ver, por ejemplo, la tabla 5, NTC). Para los propósitos de comparación, el mismo ARN objetivo se probó en las reacciones que contienen los componentes tradicionales para RT, PCR, e INVADER en un solo tubo. Esíe ensayo comprendió todos los componentes anteriores en las mismas cantidades, más un oligonucleótido adicional ubicado corriente abajo del sitio de hibridación del oligonucleótido INVADER™ incluido en la reacción a una concentración final en 1 µM. En este caso, el oligonucleótido INVADER estuvo presente en la reacción a una concentración final de 0.067 µM. También en este caso, el oligon ucleótido I NVAD ER contuvo una desig ualdad en la íerminal 3' que inhibió su extensión d uraníe la RT o PCR. Los dos ensayos se realizaron en paralelo (ver, por ejemplo, íablas 5 y 6) . Así, el uso de un solo oligonucleótido coo un cebador inverso para RT, como un cebador de PCR, y como u na estructura de división q ue forma el oligonucleótido (por ejemplo, una sonda o oligo I NVADER en una reacción de división invasiva), proporciona u na alternativa más eficiente y sensible al método tradicional para usar los oligonucleótidos múltiples para cada reacción. Tabla 5. Ol igonucleótido Multi propósito de RT/3' PCR/INVADER copias de ARN viral de VIH/rxp Prom. Neto FOZ SO 1025 1050 1003 1026 857 6.06 17 1130 1091 1090 1104 934 6.52 6 1049 1122 1097 1089 920 6.43 1.9 1073 1116 ' 1092 1094 924 6.46 0.6 62 1075 1147 795 625 4.69 0.2 170 1028 170 170 1 1.00 0.1 165 181 172 173 3 1.02 NTC ARNt 174 162 172 169 Tabla 6. RT/PCR/INVADER copias de ARN viral de VIH/rxn Prom. Neto FOZ 50 1027 048 1076 1050 833 4.83 17 1065 1116 1113 1098 880 5.04 6 1059 1089 1049 1066 848 4.90 1-9 S29 917 641 829 611 3,81 0,6 714 898 693 768 551 3.53 0.2 212 213 754 213 -5 0.98 0.1 230 252 2 1 231 13 1.06 MTC ARNt 222 221 210 218 Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incorporan en la presente por referencia como si se establecen expresamente en la presente.

Varias modificaciones y variaciones del método y sistemas descritos de la invención serán evidentes para el experto en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la invención . Aunque la invención se ha descriío con relación a las modalidades preferidas específicas, se debe eníender que la invención según lo reivindicado no se debe limiíar indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de los modos descritos para realizar la invención q ue son obvias para el experto en la técnica relevante , fienen el propósiío de esíar deníro del alcance de las sig uieníes reivindicaciones.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra, que comprende: exponer la muestra a los reacíivos del ensayo de defección bajo condiciones a modo que se deíecte el ácido nucleico objetivo, si esíá présenle, en una reacción de una sola etapa, en donde la reacción de una sola etapa comprende, una reacción de transcripción inversa, una reacción de la cadena de polimerasa y una reacción del ensayo de división invasivo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es un fluido corporal sin purificar.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de la cadena de polimerasa tiene menos de 20 ciclos de amplificación.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de la cadena de polimerasa tiene menos de 15 ciclos de amplificación.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de la cadena de polimerasa tiene menos de 12 ciclos de amplificación.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de una sola etapa comprende, un oligonucleótido mulíipropósito configurado para servir como un cebador de transcripción inversa, un cebador de reacción de la cadena de polimerasa y como un oligonucleótido de formación de estructura de división.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico objetivo es ADN genómico de mamífero.

8. El méíodo de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico objetivo es de un patógeno.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico objetivo es de una planta.

10. El método de la reivindicación 2, en donde el fluido comprende sangre.

11. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico objetivo es detectado por fluorescencia.

12. El método de la reivindicación 1, en donde los reactivos comprenden una transcripíasa inversa, polimerasa, nucleasa 5', y un amorfiguador.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la concentración de cloruro de potasio del amortiguador es 0 mM.

14. Un kit para detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra, que comprende: una transcriptasa inversa, polimerasa, nucleasa 5', oligonucleótidos configurados para crear una estructura de división invasiva en presencia de ácido nucleico objetivo, y un amortiguador que permite la transcripción inversa y la amplificación detecfable del ácido nucleico objeíivo en una reacción de una sola eíapa.

15. El kit de la reivindicación 14, en donde la nucleasa 5' comprende una endonucleasa FEN-1.

16. El kií de la reivindicación 14, en donde la concentración de cloruro de potasio del amortiguador es 0 mM.

17. El kit de la reivindicación 14, que adicionalmente comprende cebadores de amplificación.

18. El kit de la reivindicación 14, que adicionalmente comprende un oligonucleótido multipropósito configurado para servir como un cebador de transcripción inversa, cebador de reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido de formación de estrucíura de división.

19. Un kií para deíectar un ácido nucleico objetivo en una muesíra, que comprende: un oligonucleótido multipropósilo configurado para servir como un cebador de íranscripción inversa, cebador de reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido de formación de estrucíura de división en presencia de un ácido nucleico objetivo y reactivos para conducir la transcripción inversa, reacción de la cadena de polimerasa, y una reacción de división invasiva.

20. Un método para la detección múlfiple de ácidos nucleicos objetivo, que comprende: a) proporcionar la transcripción inversa, reacción de la cadena de polimerasa, y reacíivos del ensayo de división invasivo en una farjeía microfluídica, en donde los reactivos se configuran para transcribir inversamente, amplificar, y detecíar los ácidos nucleicos objeíivo; b) exponer una muesíra que se sospecha que contiene los ácidos nucleicos objetivo a los reactivos usando la fuerza centrífuga; y c) detectar la presencia o ausencia de ácidos nucleicos objetivo.

21. El método de la reivindicación 20, en donde la exposición comprende conducir 20 o menos ciclos de reacción de la cadena de polimerasa.

22. El método de la reivindicación 20, en donde los reactivos comprenden una transcriptasa inversa, polimerasa y nucleasa 5'.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la nucleasa 5' comprende una endonucleasa FEN-1.

24. Un kií que comprende una composición de enzima, en donde la composición de enzima comprende una o más enzimas que íienen actividad de transcripíasa inversa y la actividad de la endonucleasa FEN-1.

25. El kit de la reivindicación 24, en donde el kit comprende una íranscriptasa inversa.

26. El kit de la reivindicación 24, en donde el kit comprende la endonucleasa FEN-1.

27. El kit de la reivindicación 24, en donde el kit adicionalmente comprende una polimerasa.

28. Un método para cuantificar una secuencia de ácido nucleico objetivo en una muestra, que comprende exponer la muestra a los reactivos del ensayo de detección bajo las condiciones a modo que el ácido nucleico objetivo se cuantifica en una reacción de una sola etapa, en donde la reacción de una sola etapa comprende una reacción de transcripción inversa , una reacción de la cadena de polimerasa y u na reacción del ensayo de división invasivo.

29. El método de la reivindicación 28, en donde la cuantificación determina la cantidad de secuencia de ácido nucleico objetivo en relación a la cantidad de una secuencia celular de ácido nucleico en la muestra.

30. El método de la reivindicación 28, en donde los reactivos del ensayo comprenden un oligonucleótido multipropósiío config urado para servir como u n cebador de transcripción inverso , cebador de reacción de la cadena de polimerasa, y como un oligonucleótido de formación de estructura de división .